本文關(guān)鍵詞：TBK1在輻射誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及機制

  更多相關(guān)文章： 電離輻射(IR) 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) TBK1 肺纖維化 GSK-3β ZEB1

【摘要】：當(dāng)今世界，核能在工業(yè)、國防、科技、醫(yī)療等領(lǐng)域的普及應(yīng)用，它在造福人類的同時，也不可避免的給世界帶來嚴(yán)重的核輻射危險，不僅對環(huán)境造成污染，更重要的是給人類的健康安全帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。我國核能技術(shù)飛速發(fā)展，不僅擁有核武器、核潛艇等國防力量，而且擁有大量的核電站。2011年日本福島核電站因里氏9.0級地震而泄露在對日本造成巨大危害的同時也給我國帶來了核恐慌�，F(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)不斷前進，放射治療是目前臨床惡性腫瘤治療的常用方法之一。但越來越多臨床證據(jù)表明：電離輻射在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，不可避免的會造成對正常組織的損傷。盡管現(xiàn)代放療技術(shù)和方法都有很大發(fā)展，這一副作用仍嚴(yán)重影響放療在臨床上的應(yīng)用。 放射性肺纖維化是胸部腫瘤患者放射治療中常見的并發(fā)癥，也是核與輻射突發(fā)事件中受大劑量照射傷員常見的病理損傷，是導(dǎo)致腫瘤病人放療失敗和急性放射病傷員病程后期的主要死因之一。國內(nèi)外對放射性肺纖維化雖然進行了多年的研究，但輻射導(dǎo)致肺纖維化發(fā)生的機制尚不十分清楚，由于機制不清至今在臨床上還未找到防治放射性肺纖維化良好的醫(yī)學(xué)處置方法。因此，針對放射性肺纖維化發(fā)生過程中的某個關(guān)鍵環(huán)節(jié)作為靶點，以探討電離輻射(ionizing radiation, IR)與肺纖維化的關(guān)系及其機制，為防治肺纖維化的研究提供新的思路和方案。 肺纖維化以肺泡上皮細(xì)胞受損以及成纖維細(xì)胞/肌成纖維細(xì)胞聚集為特征，并有膠原及其他細(xì)胞外基質(zhì)沉積，最終影響正常肺組織修復(fù)過程及細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積而導(dǎo)致纖維化發(fā)生。由于肌成纖維細(xì)胞在這一病理過程中起重要作用，所以它的起源是肺纖維化研究的熱點和關(guān)鍵點。研究表明，在損傷因素刺激下，上皮細(xì)胞可逐漸失去上皮特性并獲得成纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞特性，即發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）。在特發(fā)性肺纖維化的動物模型以及病人標(biāo)本中，都發(fā)現(xiàn)EMT的存在。在某些因子參與和誘導(dǎo)下，與EMT相關(guān)性及特異性轉(zhuǎn)錄因子被活化，特異性細(xì)胞膜蛋白表達增強，細(xì)胞骨架蛋白發(fā)生重構(gòu)，細(xì)胞外基質(zhì)降解酶發(fā)生改變以及特異性微小RNA的變化等等細(xì)胞內(nèi)分子水平的變化都可引發(fā)并維持EMT。電離輻射是誘導(dǎo)EMT的重要因素之一。已有研究顯示microRNA-200c可以抑制EMT，而TBK1是miR-200c直接靶點。因此，探討TBK1與IR, EMT發(fā)生的相關(guān)性，以及TBK1作用的機制，將為明確放射性肺纖維化發(fā)生提供重要的實驗依據(jù)。 本研究選取肺泡上皮細(xì)胞作為實驗對象，通過EMT標(biāo)志物等指標(biāo)研究IR對EMT的影響，并圍繞TBK1表達水平的變化，對TBK1進行干擾，進一步明確TBK1及其下游信號通路在IR誘導(dǎo)EMT中的作用。 研究內(nèi)容： 1、輻射對肺泡上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響：采用人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(A549)和大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(RLE-6TN)為研究對象，給予不同照射劑量，選取不同照射時間，觀察在此條件下EMT標(biāo)志物變化情況，建立輻射誘導(dǎo)EMT細(xì)胞模型； 2、干擾TBK1對輻射誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響：①脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siTBK1，明確干擾效果；②干擾TBK1后選擇適當(dāng)劑量及時間照射，觀察EMT變化； 3、TBK1對輻射誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機制探討：①干擾TBK1，觀察輻射誘導(dǎo)EMT細(xì)胞模型中EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的變化；②TBK1作用可能相關(guān)信號通路探討。 實驗方法： 1、采用人肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(A549)和大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(RLE-6TN)，對其進行2、4、6、8、10Gy60Co γ射線照射，通過Western Blot (WB)實驗技術(shù)，檢測EMT標(biāo)志物，建立輻射誘導(dǎo)EMT細(xì)胞模型； 2、通過WB檢測輻射對細(xì)胞TBK1表達水平的影響； 3、利用lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法干擾細(xì)胞中TBK1的表達，用WB及Real-time-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果； 4、干擾TBK1，通過WB，免疫熒光實驗檢測EMT標(biāo)記物變化，評價TBK1對IR誘導(dǎo)EMT影響； 5、干擾TBK1，采用Real-time PCR和WB檢測EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的變化；以及過表達轉(zhuǎn)錄因子ZEB1對TBK1調(diào)節(jié)IR誘導(dǎo)EMT的效應(yīng)； 6、干擾TBK1，采用Real-time PCR檢測照射后細(xì)胞TGF-β表達變化；通過WB實驗，觀察TGF-β/Smad3通路是否參與TBK1的調(diào)節(jié)； 7、干擾TBK1，采用WB檢測照射后細(xì)胞NF-κB通路表達變化，觀察其是否參與TBK1的調(diào)節(jié)； 8、干擾TBK1，采用WB檢測照射后細(xì)胞GSK-3β的表達變化，通過給予GSK-3β特異性抑制劑SB216763，觀察GSK-3β在TBK1調(diào)節(jié)IR誘導(dǎo)EMT中的作用；聯(lián)合過表達轉(zhuǎn)錄因子ZEB1，探討TBK1和GSK-3β的關(guān)系。 9、統(tǒng)計方法：采用t檢驗；方差分析等， P＜0.05即有統(tǒng)計學(xué)差異意義。 實驗結(jié)果： 1、8Gyγ射線照射72h后，兩種肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞均呈現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞樣變化，發(fā)生EMT，表現(xiàn)為：與正常對照組相比，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達降低，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達增高，提示8Gy照射后72h能夠誘導(dǎo)細(xì)胞EMT的發(fā)生； 2、兩種細(xì)胞經(jīng)8Gyγ射線照射后，TBK1的表達水平呈時間依賴性升高； 3、用lipo2000轉(zhuǎn)染siTBK1后，與對照組相比，TBK1表達水平明顯下降； 4、8Gyγ射線照射72h后，與對照組相比，干擾TBK1可以調(diào)節(jié)IR誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。表現(xiàn)為：上皮標(biāo)志物E-cadherin表達上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達下調(diào)； 5、8Gyγ射線照射72h后，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如ZEB1等表達上調(diào)；干擾TBK1后，與單純照射組相比，轉(zhuǎn)錄因子ZEB1表達下調(diào)，同時過表達ZEB1可以逆轉(zhuǎn)干擾TBK1的效應(yīng)，提示TBK1調(diào)節(jié)IR誘導(dǎo)EMT可能是通過轉(zhuǎn)錄因子ZEB1起作用； 6、8Gyγ射線照射72h后，TGF-β表達水平升高，但干擾TBK1并不能下調(diào)TGF-β表達；同時，照射后p-Smad3水平升高，但干擾TBK1并不能影響p-Smad3水平，提示TGF-β/Smad3通路可能非TBK1作用通路； 7、8Gyγ射線照射72h后，可以活化細(xì)胞內(nèi)NF-κB通路，表現(xiàn)為：IκB-α表達下調(diào)，p-IκB-α表達上調(diào)；但干擾TBK1并不能影響IκB-α及p-IκB-α表達，提示NF-κB通路可能并非TBK1作用通路； 8、8Gyγ射線照射72h后，p-GSK-3β表達上調(diào)，提示GSK-3β失活；干擾TBK1后p-GSK-3β水平下調(diào)，提示GSK-3β活性升高；同時，給予GSK-3β抑制劑SB216763，可以增強干擾TBK1的效應(yīng)，表現(xiàn)為：上皮標(biāo)志物E-cadherin表達上調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin表達下調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子ZEB1表達下調(diào)，提示TBK1可能通過GSK-3β調(diào)節(jié)IR誘導(dǎo)EMT。 討論與分析： 放射性肺纖維化是影響腫瘤病人放療效果和導(dǎo)致急性放射病傷員病程后期的主要死因之一，是國內(nèi)外放射生物學(xué)界長期關(guān)注的研究熱點和亟待破解的難題。目前，研究顯示EMT在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而電離輻射是EMT的重要誘導(dǎo)因素之一；本實驗室前期研究提示TBK1是miR-200c直接靶點且具有癌基因樣作用。在此基礎(chǔ)上，我們考慮通過對TBK1及EMT的研究以期為揭示放射性肺纖維化機制提供實驗依據(jù)。本課題研究中觀察到TBK1在輻射誘導(dǎo)的肺纖維化中發(fā)揮了重要作用，干擾TBK1能夠抑制IR對EMT的誘導(dǎo)作用。在對TBK1作用機制的初步探討中，，觀察到干擾TBK1可影響EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1的表達，通過RESCURE實驗提示TBK1與ZEB1具有一定關(guān)聯(lián)，在揭示這種關(guān)聯(lián)時，觀察到TGF-β/Smad3及NF-κB通路可能并未參與到TBK1對EMT的調(diào)節(jié)通路中，而另一細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的蛋白激酶GSK-3β可能是TBK1調(diào)節(jié)ZEB1的中間蛋白。 結(jié)論： IR能夠誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生，TBK1在此過程中起負(fù)向調(diào)節(jié)作用；其中TBK1的調(diào)節(jié)作用可能是通過抑制GSK-3β磷酸化而活化GSK-3β及抑制轉(zhuǎn)錄因子ZEB1實現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：電離輻射(IR) 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT) TBK1 肺纖維化 GSK-3β ZEB1
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R730.55
【目錄】：

• 摘要5-9
• Abstract9-14
• 縮略詞表14-15
• 前言15-17
• 技術(shù)路線17-18
• 第一部分：輻射對肺泡上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響18-31
• 一、材料19-20
• 二、方法20-21
• 三、結(jié)果21-28
• 四、結(jié)論28
• 五、討論28-31
• 第二部分：TBK1 在輻射誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用31-45
• 一、材料31-33
• 二、方法33-35
• 三、結(jié)果35-43
• 四、結(jié)論43
• 五、討論43-45
• 第三部分：TBK1 在輻射誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的機制探討45-60
• 一、材料46-48
• 二、方法48-50
• 三、結(jié)果50-58
• 四、結(jié)論58
• 五、討論58-60
• 全文總結(jié)60-62
• 參考文獻62-65
• 文獻綜述65-79
• 參考文獻70-79
• 附錄79-93
• 在讀期間發(fā)表論文93-94
• 致謝94

【共引文獻】

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本文編號：860847