本文關(guān)鍵詞：SFRP5 mRNA在大鼠骨骼肌挫傷組織中表達規(guī)律的研究

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【摘要】：目的:在肌肉損傷后差異表達基因篩選的基礎上,應用Real-time PCR技術(shù)檢測大鼠肌肉挫傷后組織中分泌型卷曲相關(guān)蛋白5(secreted frizzled-related protein 5,SFRP5)m RNA在肌肉組織中的表達情況,并分析其與挫傷時間、損傷類型和挫傷程度的關(guān)系,以及SFRP5 m RNA在肌肉損傷修復過程中的作用,為法醫(yī)病理學和法醫(yī)工作中,推斷損傷時間提供依據(jù)。方法:(1)動物分組:132只成年的Sprague-Daley大鼠,按隨機分配的原則將大鼠分為以下6組:A組:正常對照組(n=6只);B組:損傷組(又可分為12組:分別為4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h和48h組)(n=6只);C組:對側(cè)組(損傷組的對側(cè)未損傷組織24h、36h和48h)(n=6只);D組:不同損傷程度組(共4組:輕傷組4h和8h,重傷組4h和8h)(n=6只)、E:死后組(共3組:死后12h、18h和24h)(n=6只)、F:切創(chuàng)傷組(共2組:4h和8h)(n=6只)(2)模型制備:A組:正常對照組:將正常大鼠無痛處死,取其右后肢骨骼肌做檢材;B組:損傷組:用自由落體的方法打擊大鼠的右后肢骨骼肌,分別在傷后規(guī)定的時間點將大鼠無痛處死,在損傷的位置進行取材;C組:對側(cè)組:在損傷組的24h、36h和48h三個時間點的左側(cè)骨骼肌進行取材;D組:不同損傷程度組:將重力錘從200cm和130cm高度處分別自由落下,并分別于損傷后的4小時和8小時兩個時間點進行取材;E組:死后組:將大鼠無痛處死以后,在工氣候箱中保存,然后在規(guī)定的時間點于大鼠右側(cè)后肢相同部位進行取材;F:切創(chuàng)組:將大鼠右后肢內(nèi)側(cè)皮膚全層切開,切割骨骼肌以制作切創(chuàng)模型,并將其于切創(chuàng)后4小時和8小時兩個時間點無痛處死,并取材。(3)根據(jù)Invitrogen TRIzol Reagent試劑盒的操作說明,對總RNA進行提取,并測得樣本總RNA的OD260/OD280的比值,同時對核酸的純度也進行評價。(4)總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成c DNA,以RPL13 m RNA看家基因為內(nèi)參進行Real-time PCR檢測,結(jié)果以2-△△Ct的方法來計算各實驗組與正常對照組之間SFRP5 m RNA的相對表達量。結(jié)果:(1)經(jīng)TRIzol Teagent試劑提取的總RNA樣本其OD260/OD280比值均在1.8~2.2之間。(2)SFRP5 m RNA與RPL13 m RNA的擴增效率分別為110.5%和120.2%,相關(guān)系數(shù)分別為0.995和0.982,說明二者的擴增效率基本一致,可以認為RPL13m RNA能用作SFRP5 m RNA的內(nèi)參基因。(3)在大鼠肌肉挫傷后48小時內(nèi)SFRP5m RNA的相對表達量均降低,且隨著時間的變化呈現(xiàn)出先降低后增高的趨勢。在肌肉挫傷后的4、8、12、16和20小時SFRP5 m RNA表達量分別為正常組的65.0%、44.6%、36.1%、31.4%、22.3%,之后在24、28、32、36、40、44和48小時SFRP5 m RNA表達量分別為對照組的26.3%、36.3%、37.2%、47.3%、50.4%、61.8%、68.8%。與正常對照組相比,其表達變化量在22.3%-68.8%之間波動。(4)與正常對照組相比較,同一只大鼠的對側(cè)未損傷肌肉組織中SFRP5 m RNA的表達量無統(tǒng)計學差異(P0.05),由此可以推測,在采用SFRP5 m RNA進行損傷時間推斷時,其自身對側(cè)未損傷部位的肌肉組織可以做為正常對照對損傷區(qū)域表達量進行相對定量分析。(5)在輕度損傷和重度損傷SFRP5 m RNA均出現(xiàn)下調(diào),但其各自的重傷和輕傷SFRP5m RNA的相對表達量之間相比,無統(tǒng)計學差異(P0.05),說明SFRP5m RNA的相對表達量與損傷的程度無關(guān)。(6)SFRP5 m RNA在死后組的表達量與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),由此可以推測,在死后的24小時之內(nèi)SFRP5 m RNA的表達水平相對來說仍然比較穩(wěn)定,即在死亡后的24小時以內(nèi),并不會對損傷時間的推斷產(chǎn)生影響。(7)切創(chuàng)組與挫傷組SFRP5 m RNA的表達量與正常對照組相比,都明顯的降低,但在傷后4小時,切創(chuàng)組與挫傷組存在明顯差異,而在8小時切創(chuàng)組與挫傷組SFRP5m RNA的表達差異不明顯;結(jié)論:分泌型卷曲相關(guān)蛋白5 m RNA僅在損傷處肌肉組織中其表達量呈現(xiàn)出先下降再升高的變化趨勢,還沒有發(fā)現(xiàn)其變化趨勢和損傷程度相關(guān)聯(lián),是否與損傷的類型有關(guān)聯(lián)還需要我們做進一步的研究,且SFRP5 m RNA在死后24小時以內(nèi)未發(fā)生明顯降解,有望成為損傷時間推斷的指標之一。
【關(guān)鍵詞】：法醫(yī)病理學 損傷時間推斷 實時定量PCR SFRP5 mRNA 挫傷
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：D919
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-16
• 1 材料與方法16-23
• 1.1 材料16-17
• 1.2 方法17-21
• 1.3 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計學處理21-23
• 2 結(jié)果23-31
• 2.1 總RNA評價與鑒定結(jié)果23
• 2.2 Real-Time PCR結(jié)果23-31
• 3 討論31-36
• 4 結(jié)論36-37
• 參考文獻37-40
• 綜述40-53
• 參考文獻49-53
• 致謝53-54
• 在學期間承擔/參與的科研課題與研究成果54-55
• 個人簡歷55

【參考文獻】

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本文編號：799240