本文關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)內(nèi)、外源IGF-Ⅰ表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：研究目的:興奮劑問題一直以來(lái)都是困擾所有體育賽事的主要問題之一,世界反興奮劑機(jī)構(gòu)禁止在一切運(yùn)動(dòng)賽事中使用興奮劑。然而對(duì)于興奮劑的有效檢測(cè)卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于興奮劑的研發(fā)與使用。本實(shí)驗(yàn)通過研究基因興奮劑IGF-Ⅰ,建立一種檢測(cè)區(qū)分內(nèi)、外源基因表達(dá)的方法,為基因興奮劑的有效檢測(cè)提供理論依據(jù)。研究方法:本實(shí)驗(yàn)采用r AAV2介導(dǎo)IGF-Ⅰ的方法將外源基因注射進(jìn)入小鼠肌肉,用以檢測(cè)區(qū)分內(nèi)、外源基因的表達(dá)情況。研究對(duì)象為30只雄性ICR小鼠,隨機(jī)分為空白對(duì)照組(n=6)、注射3d組(n=6)、注射7d組(n=6)、注射14d組(n=6)、注射30d組(n=6)。構(gòu)建含有目的基因IGF-Ⅰ的質(zhì)粒,并進(jìn)行病毒包裝。在小鼠右側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)上方斜行進(jìn)針進(jìn)行病毒注射,每組按照不同的實(shí)驗(yàn)天數(shù)分別提取肌肉和血液中的DNA。通過在IGF-Ⅰ基因序列外顯子2,3之間設(shè)計(jì)特異性的熒光探針來(lái)識(shí)別外源性IGF-Ⅰ基因,合成ITC基因以及相應(yīng)的ITC探針,作為實(shí)驗(yàn)內(nèi)部閾值調(diào)控的模版。以肌肉和血液提取得到的樣本DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,實(shí)驗(yàn)過程中樣本DNA、ITC質(zhì)粒、IGF-Ⅰ目的探針、ITC探針、引物等放在同一體系中反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后通過比較IGF-Ⅰ目的探針與ITC探針Ct值的大小,來(lái)排除實(shí)驗(yàn)過程中外界因素的干擾。通過比較相應(yīng)組別的Ct值,來(lái)確定IGF-Ⅰ的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Excel與SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。研究結(jié)果:(1)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR過程中,通過實(shí)驗(yàn)儀器能夠捕捉到目的探針熒光信號(hào)的積累,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)過程中注射的外源性IGF-Ⅰ在小鼠體內(nèi)得到表達(dá),本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法,能夠檢測(cè)到外源基因的表達(dá)。(2)不同時(shí)間獲取肌肉,提取DNA進(jìn)行PCR,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增多Ct值逐漸增大,且3d組與7d組之間Ct值升高明顯,14d組與30d組之間Ct值升高趨于緩慢;不同時(shí)間獲取血液,提取DNA進(jìn)行PCR,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增多Ct值變化的趨勢(shì)不明顯,但二者Ct值均小于空白對(duì)照組Ct值。(3)分別以肌肉和血液提取DNA為模版進(jìn)行PCR,在3d,7d組,肌肉DNA的Ct值小于血液DNA的Ct值,兩者之間差異顯著(P0.01)。14d,30d組,肌肉DNA的Ct值大于血液DNA的Ct值,且兩者之間差異顯著(P0.01)。(4)以不同取材量肌肉、血液提取DNA為模版進(jìn)行PCR,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同取材量PCR后的Ct值兩者之間沒有顯著性的差異(P0.05)。研究結(jié)論:(1)本實(shí)驗(yàn)建立的方法能有效的檢測(cè)區(qū)分內(nèi)、外源IGF-Ⅰ的表達(dá)。(2)不同取材時(shí)間對(duì)肌肉的檢測(cè)結(jié)果有顯著影響,對(duì)血液的檢測(cè)結(jié)果沒有影響。(3)不同取材組織對(duì)檢測(cè)結(jié)果有較大影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)束顯示,基因注射后7天內(nèi)肌肉檢測(cè)比血液檢測(cè)更穩(wěn)妥,注射7天后血液檢測(cè)比肌肉檢測(cè)更有利。(4)不同取材量對(duì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的結(jié)果沒有影響。
【關(guān)鍵詞】：基因興奮劑 胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ 腺相關(guān)病毒 檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R440;R87
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• abstract6-10
• 序言10-12
• 1 文獻(xiàn)綜述12-25
• 1.1 興奮劑及興奮劑的檢測(cè)12-21
• 1.1.1 現(xiàn)代奧運(yùn)會(huì)的發(fā)展及興奮劑問題的出現(xiàn)12-13
• 1.1.2 興奮劑問題13-16
• 1.1.3 基因興奮劑16-20
• 1.1.4 興奮劑的檢測(cè)20-21
• 1.2 胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）概述21-23
• 1.2.1 IGF-Ⅰ21-22
• 1.2.2 IGF-Ⅰ的生理作用22-23
• 1.2.3 基因興奮劑IGF-Ⅰ23
• 1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)23-24
• 1.4 總結(jié)24-25
• 2 材料與方法25-37
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組25
• 2.2 攜帶人IGF-Ⅰ基因pTR-IGF-Ⅰ-GFP質(zhì)粒的構(gòu)建25-28
• 2.3 rAAV2-IGF-Ⅰ重組腺相關(guān)病毒的包裝、純化及滴度測(cè)定28-32
• 2.3.1 rAAV2-IGF-Ⅰ重組腺相關(guān)病毒的包裝28-29
• 2.3.2 rAAV2-IGF-Ⅰ重組腺相關(guān)病毒的純化29
• 2.3.3 rAAV2-IGF-Ⅰ重組腺相關(guān)病毒蛋白外殼的鑒定29-30
• 2.3.4 Western-blot檢測(cè)rAAV介導(dǎo)的IGF-Ⅰ表達(dá)30
• 2.3.5 rAAV2-IGF-Ⅰ重組腺相關(guān)病毒滴度的測(cè)定30-32
• 2.4 rAAV2-IGF-Ⅰ重組腺相關(guān)病毒肌肉注射32
• 2.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的取材及測(cè)試指標(biāo)32
• 2.5.1 血液相關(guān)指標(biāo)的取材32
• 2.5.2 肌肉相關(guān)指標(biāo)的取材32
• 2.6 ITC模版的建立：引物-探針的設(shè)計(jì)32-34
• 2.7 Real time PCR（探針法）體系及條件34-35
• 2.7.1 Real time PCR儀器檢測(cè)限度測(cè)定34
• 2.7.2 樣品DNA檢測(cè)體系及反應(yīng)條件34-35
• 2.8 實(shí)驗(yàn)所需主要儀器及試劑35-36
• 2.8.1 實(shí)驗(yàn)主要儀器35-36
• 2.8.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑36
• 2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理36-37
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-43
• 3.1 pTR-IGF-Ⅰ-GFP質(zhì)粒構(gòu)建鑒定結(jié)果37
• 3.2 rAAV2-IGF-Ⅰ重組腺相關(guān)病毒包裝及鑒定結(jié)果37-38
• 3.3 rAAV2-IGF-Ⅰ重組腺相關(guān)病毒滴度測(cè)定結(jié)果38-39
• 3.4 Real time PCR儀檢測(cè)精度測(cè)定結(jié)果39-40
• 3.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果特異性、可信性及重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果40-41
• 3.6 不同取材時(shí)間、不同取材組織Real time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-42
• 3.7 不同取材量Real time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-43
• 4 分析與討論43-49
• 4.1 腺相關(guān)病毒（AAV）作為基因?qū)塍w內(nèi)載體的可行性43-45
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的特異性、可信性及重復(fù)性45-46
• 4.3 不同取材時(shí)間、不同取材組織對(duì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的影響46-47
• 4.4 不同取材量對(duì)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的影響47-48
• 4.5 本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)不足之處48-49
• 5 結(jié)論49-50
• 6 參考文獻(xiàn)50-56
• 7 攻讀碩士學(xué)位期間公開發(fā)表論文56-57
• 8 附錄57-58
• 9 致謝58-59

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 陳旭;齊鳳坤;康立功;李景富;;實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J];東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2010年08期

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6 曾凡星;回顧與反思:興奮劑的使用與禁用[J];天津體育學(xué)院學(xué)報(bào);2002年01期

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本文編號(hào)：786937