本文關(guān)鍵詞：抗精子適體的制備及其在精子富集上的研究

  更多相關(guān)文章： 核酸適體 精子細(xì)胞檢測 鏈霉素磁珠 單鏈 DNA 磁分離 短串聯(lián)重復(fù)序列

【摘要】：探索精子細(xì)胞的高敏感高特異性新檢測方法對于實(shí)現(xiàn)法醫(yī)學(xué)中精斑的確認(rèn)與個(gè)體識別具有極其重要的意義。傳統(tǒng)的精斑、精子檢測方法主要有通過鏡檢觀察精子的細(xì)胞形態(tài),抗原抗體反應(yīng)或者檢測精斑中特殊含量的酶等。確定精斑后,可通過差異裂解等方法分離出精子DNA,再進(jìn)行精子DNA擴(kuò)增與后續(xù)DNA分型。這些方法往往因?yàn)殡s質(zhì)(包括女性陰道上皮細(xì)胞DNA)的干撓而存在敏感性低,甚至假陽性等局限性。核酸適體(aptamer)因其親和力高、特異性強(qiáng)、合成經(jīng)濟(jì)、易保存,可通過熒光基團(tuán)等修飾使其與靶標(biāo)的結(jié)合成為可視性等優(yōu)點(diǎn),被用作為一類新型分子探針,即可用來作為識別探針,也可用來構(gòu)建捕捉工具,廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞的檢測和富集中。本課題體外合成長度為84個(gè)堿基(包含已知序列的上、下游引物各22個(gè)堿基)的隨機(jī)單鏈作為初級文庫,通過全細(xì)胞改良指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化(cell-SELEX)技術(shù)篩選出7條與精子細(xì)胞特異性結(jié)合的單鏈DNA適體,利用Clustal2.05、mfold軟件對DNA適體序列進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)同源性分析和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,然后采用熒光標(biāo)記法檢測單鏈DNA適體與精子細(xì)胞的特異性結(jié)合,挑選出與精子細(xì)胞特異性結(jié)合的A-3適體進(jìn)行精子細(xì)胞富集實(shí)驗(yàn)。精子細(xì)胞富集實(shí)驗(yàn)中將生物素修飾的A-3適體固定在鏈霉素磁珠上,通過生物素-鏈霉親和素的作用,制備了能特異性捕獲、富集精子細(xì)胞的A-3適體功能化磁珠。該A-3適體功能化磁珠捕獲精子細(xì)胞后,在簡單的磁場力下即可對精子細(xì)胞進(jìn)行富集。在精子細(xì)胞數(shù)量超過10000時(shí),捕獲效率穩(wěn)定在60%以上,A-3適體功能化磁珠對精子細(xì)胞的最低檢測線為100個(gè)數(shù)量級。當(dāng)細(xì)胞混合液中10000/m L的精子細(xì)胞和10000/m L上皮細(xì)胞時(shí),A-3適體功能化磁珠可以將其中64.26%的精子細(xì)胞分離出來,分離純度超過了96%。我們采用特異性A-3適體結(jié)合磁珠建立了精子分離技術(shù),并進(jìn)一步建立以富集為特征的精子細(xì)胞檢測新方法。該方法既可以用來在光學(xué)顯微鏡下直接檢驗(yàn)精子細(xì)胞,也可以用來提高其他檢測手段(例如下游的PCR法)的敏感性。本課題通過法醫(yī)學(xué)上的實(shí)際應(yīng)用,進(jìn)一步驗(yàn)證了磁珠富集分離法的實(shí)用性。由性犯罪現(xiàn)場取證回來的9份精斑痕跡標(biāo)本,按常規(guī)方法制備提取液。A-3適體功能化磁珠因生物素標(biāo)記的A-3適體能特異捕獲精斑提取液中的精子,在簡單的磁場力作用下便能通過生物素-連霉親和素作用力實(shí)現(xiàn)精子細(xì)胞的富集。將富集得到的精子細(xì)胞進(jìn)行STR(短串聯(lián)重復(fù)序列)基因座的單一男性分型。傳統(tǒng)的差異裂解法作為對照。初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,差異裂解法成功得到三份精斑STR基因座的單一男性分型,磁珠分離法得到兩份。其中有一份標(biāo)本同時(shí)成功地被差異裂解法和磁珠分離法陽性檢出,檢測結(jié)果彼此一致;另有一份標(biāo)本未能被差異裂解法檢出,但用磁珠分離法成功地檢出分型,其結(jié)果與嫌疑犯的血液標(biāo)本檢測結(jié)果一致。本研究通過改良的cell-SELEX方法篩選了7條抗人精子aptamer,通過熒光顯微鏡對混合細(xì)胞的檢測證實(shí)了aptamer結(jié)合精子的特異性。其中A-3 aptamer用來進(jìn)一步研究,建立了基于aptamer的精子分離法,進(jìn)一步用來檢測精斑。實(shí)驗(yàn)所用試劑和儀器簡單,所用時(shí)間較傳統(tǒng)方法大大減少,有望成為當(dāng)前法醫(yī)常規(guī)精斑檢測法的一種互補(bǔ)方法,提高精子檢測準(zhǔn)確率。
【關(guān)鍵詞】：核酸適體 精子細(xì)胞檢測 鏈霉素磁珠 單鏈 DNA 磁分離 短串聯(lián)重復(fù)序列
【學(xué)位授予單位】：華僑大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：D919
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 主要符號對照表10-11
• 第1章 引言11-25
• 1.1 抗精子適體課題來源11-12
• 1.2 精斑檢測的重要性12
• 1.3 精子細(xì)胞富集的重要性12-13
• 1.4 精斑檢測方法的進(jìn)展13-15
• 1.5 現(xiàn)階段精斑確定與精子分離技術(shù)的研究15-17
• 1.6 精子細(xì)胞檢測中的識別探針17-18
• 1.6.1 基于抗原-抗體反應(yīng)的識別探針17
• 1.6.2 基于受體配體作用的識別探針17-18
• 1.7 核酸適體探針18-19
• 1.8 適體和抗體的比較19-20
• 1.9 磁珠分選法20-21
• 1.10 STR基因座21-23
• 1.11 課題介紹23-25
• 第2章 抗精子細(xì)胞的寡核苷酸適體的篩選和鑒定25-50
• 2.1 前言25
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分25-40
• 2.2.1 試劑和儀器26-29
• 2.2.2 cell-SELEX試驗(yàn)總流程圖29
• 2.2.3 文庫的制備與引物的合成29-30
• 2.2.4 精子細(xì)胞的處理30
• 2.2.5 精子細(xì)胞適體篩選30-37
• 2.2.6 TOPO TA克隆適體特異性分析37-40
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論40-47
• 2.3.1 PCR條件優(yōu)化結(jié)果40-41
• 2.3.2 不同篩選輪數(shù)的PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果41
• 2.3.3 熒光基團(tuán) 6-FAM和Alexa Fluor 488對PCR產(chǎn)物影響的比較41-42
• 2.3.4 TOPO TA克隆42-44
• 2.3.5 適體一級結(jié)構(gòu)同源性分析44
• 2.3.6 適體二級結(jié)構(gòu)預(yù)測44-46
• 2.3.7 熒光顯微鏡檢測候選適體與精子細(xì)胞的特異性46-47
• 2.4 討論47-50
• 第3章 基于核酸適體靶向識別功能的精子細(xì)胞磁分離和富集研究50-61
• 3.1 前言50-51
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分51-54
• 3.2.1 試劑和儀器51-52
• 3.2.2 核酸適體功能化磁珠的制備52-53
• 3.2.3 核酸適體在磁珠表面的修飾率表征53
• 3.2.4 精子細(xì)胞的染色53
• 3.2.5 A-3 適體功能化磁珠對精子細(xì)胞的特異性捕獲與富集53
• 3.2.6 核酸適體功能化磁珠對混合體系中精子細(xì)胞的特異性捕獲與富集53-54
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-59
• 3.3.1 實(shí)驗(yàn)原理54-55
• 3.3.2 核酸適體在磁珠表面的修飾效率表征55
• 3.3.3 核酸適體A-3 的特異性分析55-56
• 3.3.4 核酸適體功能化磁珠對精子細(xì)胞的特異性捕獲與富集56-58
• 3.3.5 核酸適體功能化磁珠對混合體系中精子細(xì)胞的特異性捕獲與富集58-59
• 3.4 討論59-61
• 第4章 精子細(xì)胞DNA的STR分型61-68
• 4.1 前言61
• 4.2 實(shí)驗(yàn)部分61-64
• 4.2.1 試劑和儀器61-63
• 4.2.2 檢材處理63
• 4.2.3 精子細(xì)胞的磁珠結(jié)合與分離63
• 4.2.4 多位點(diǎn)STR復(fù)合擴(kuò)增63-64
• 4.2.5 DNA樣品電泳64
• 4.2.6 結(jié)果分析64
• 4.3 結(jié)果64-66
• 4.3.1 磁珠富集法分離精子細(xì)胞DNA分型檢測情況64-66
• 4.4 討論66-68
• 第5章 結(jié)論與展望68-70
• 參考文獻(xiàn)70-75
• 致謝75-76
• 個(gè)人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文和研究成果76

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 李鑫;胡蘭;郭紅玲;劉志芳;Q謎，

本文編號：765855