發(fā)布時間：2017-08-28 21:19

  本文關(guān)鍵詞：低氧誘發(fā)自噬對喉癌Hep-2細胞放化療敏感性的影響及Stat3對自噬調(diào)控作用

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【摘要】：目的：觀察低氧微環(huán)境對喉癌Hep-2細胞增殖情況的影響及其對細胞自噬的作用，進一步研究細胞自噬對喉癌Hep-2細胞放化療敏感性的影響，探究Stat3信號通路對細胞自噬的調(diào)控作用及可能機制，尋求腫瘤預(yù)防和治療的新策略。 方法： 1體外常氧和低氧條件下培養(yǎng)喉癌Hep-2細胞，給予不同濃度順鉑(0μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L,80μmol/L,160μmol/L），不同劑量放射線（0Gy,5Gy,10Gy,15Gy,20Gy）后繼續(xù)培養(yǎng)24h, MTT方法檢測細胞增殖情況。 2體外不同時間（3h,6h,9h,12h,24h）低氧培養(yǎng)喉癌Hep-2細胞，Western blot法檢測蛋白Stat3, p-Stat3, HIF-1ɑ及自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達情況。給予Jak激酶抑制劑AG490(40mg/L)預(yù)處理1h繼續(xù)低氧培養(yǎng)6h,12h,24h后，Western blot法檢測蛋白Stat3, p-Stat3及自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達情況。 3體外經(jīng)AG49040mg/L預(yù)處理1h，，3-MA (4mmol/L)預(yù)處理3h聯(lián)合不同濃度順鉑（0μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L,80μmol/L），不同劑量放射線（0Gy,5Gy,10Gy,15Gy）繼續(xù)低氧培養(yǎng)24h，MTT方法檢測細胞增殖情況。雷帕霉素(100nmol/L)預(yù)處理3h聯(lián)合不同濃度順鉑化療（0μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L,80μmol/L），不同劑量放射線放療（0Gy,5Gy,10Gy,15Gy）后繼續(xù)常氧培養(yǎng)24h，MTT方法檢測胞增殖情況。Western blot的方法檢測分別經(jīng)3-MA和雷帕霉素處理后自噬標志性蛋白LC3的表達情況。 結(jié)果：1不同濃度的順鉑、不同劑量的放射線干預(yù)喉癌Hep-2細胞后對細胞增殖具有抑制作用且具有濃度依賴性和劑量依賴性，不同濃度順鉑化療組：低氧F=192.110，P=0.000＜0.01，常氧F=123.146，P=0.000＜0.01；不同劑量放射線放療組：低氧F=103.438，P=0.000＜0.05,常氧F=264.641，P=0.000＜0.01；差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（方差分析的統(tǒng)計學(xué)方法）。常氧組與低氧組相比,不同濃度順鉑化療和不同劑量放射線放療，低氧組細胞的增殖抑制作用明顯下降，P0.01（獨立樣本T檢驗的統(tǒng)計學(xué)方法），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 2不同處理方式后蛋白Stat3, p-Stat3, HIF-1ɑ及自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達變化情況。 2.1不同低氧時間（0h,3h,6h,9h,12h,24h）培養(yǎng)Hep-2細胞Western blot法檢測蛋白Stat3, p-Stat3, HIF-1ɑ及自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達情況，方差分析的統(tǒng)計學(xué)方法進行分析。與常氧條件下相比較Stat3蛋白在低氧條件下無明顯變化，P0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;蛋白p-Stat3及自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3蛋白的變化于低氧6h后逐漸升高，24h達到較高水平，低氧培養(yǎng)6h,9h,12h,24h與常氧比較蛋白表達明顯升高，P0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；HIF-1ɑ蛋白的表達情況于低氧9h開始逐漸升高，24h達到高峰，P0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 2.2體外低氧培養(yǎng)Hep-2細胞，給予AG490預(yù)處理1h后繼續(xù)低氧培養(yǎng)6h,12h,24h，不同時間點AG490組與未加AG490組比較，Stat3蛋白表達無明顯變化，P0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義；蛋白p-Stat3, Beclin1和LC3表達明顯下降，6h,12h,24h, P0.01,差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(獨立樣本T檢驗的統(tǒng)計學(xué)分析方法)。 2.33-MA (4mmol/L)、雷帕霉素（100nmol/L）預(yù)處理3h繼續(xù)分別低氧和常氧條件下培養(yǎng)24h,常氧組（24N）和常氧加雷帕霉素組（24N+RAPA）比較，24N+RAPA組LC3蛋白表達情況明顯高于24N組, t=11.162, P=0.000＜0.01,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；低氧組（24H）與低氧加3-MA組（24H+3-MA）比較，24H+3-MA組LC3蛋白表達情況明顯低于24H組，t=13.074, P=0.000＜0.01,差異同樣具有顯著差統(tǒng)計學(xué)意義（獨立樣本T檢驗的統(tǒng)計學(xué)方法）。 3MTT檢測不同濃度順鉑、不同劑量放射線與AG490,3-MA及雷帕霉素聯(lián)合應(yīng)用后對細胞增殖的影響，獨立樣本T檢驗的統(tǒng)計學(xué)方法進行數(shù)據(jù)分析。 3.1體外經(jīng)AG49040mg/L預(yù)處理1h，3-MA (4mmol/L)預(yù)處理3h后聯(lián)合不同濃度順鉑化療、不同劑量放射線放療繼續(xù)低氧條件下培養(yǎng)24h后，MTT檢測細胞增殖情況，AG490，3-MA組與僅放化療組相比，細胞增殖抑制明顯增加，當(dāng)順鉑濃度為10μmol/L，3-MA組與單純化療組相比P0.05，其他AG490，3-MA組與僅放化療組相比P0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 3.2體外雷帕霉素(100nmol/L)預(yù)處理3h后聯(lián)合不同濃度順鉑化療，不同放射劑量放療后繼續(xù)常氧培養(yǎng)24h后，雷帕霉素組細胞增殖抑制較僅放化組明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(聯(lián)合應(yīng)用雷帕霉素組與單純放射線放療相比，僅10Gy,15Gy時P0.05,其他各組P0.01)。 結(jié)論： 1不同濃度順鉑化療和不同劑量放射線放療在低氧和常氧條件下均對Hep-2細胞增殖具有抑制作用，且低氧可以增加腫瘤細胞對放化療的抵抗。 2低氧可以促進Hep-2細胞Stat3的磷酸化，誘導(dǎo)HIF-1ɑ的表達，而對總Stat3沒有影響；低氧可以促進自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達，誘發(fā)細胞自噬。抑制Stat3的磷酸化可以抑制自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達，從而抑制自噬過程，增加腫瘤細胞低氧放化療敏感性。 33-MA可以抑制喉癌Hep-2細胞低氧誘發(fā)的自噬，減少自噬相關(guān)蛋白LC3的表達,增強腫瘤細胞低氧放化療敏感性；雷帕霉素可以誘發(fā)Hep-2細胞自噬，增加自噬相關(guān)蛋白LC3的表達，增強常氧條件腫瘤細胞的放化療敏感性。
【關(guān)鍵詞】：低氧 自噬 喉腫瘤 放療敏感性 化療敏感性 增敏作用 Stat3信號通路
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.65;R730.55
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-23
• 結(jié)果23-27
• 附圖27-32
• 附表32-36
• 討論36-40
• 結(jié)論40
• 參考文獻40-44
• 綜述 自噬與低氧微環(huán)境下腫瘤細胞放化療敏感性關(guān)系的研究進展44-55
• 參考文獻50-55
• 致謝55-56
• 個人簡歷56

【參考文獻】

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1 劉春玲;李曉明;路秀英;張立坤;;HIF-1α反義寡核苷酸對喉鱗狀細胞癌hep-2細胞放療的增效作用[J];臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志;2007年13期

本文編號：749541