本文關(guān)鍵詞：UVA輻射誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞損傷過(guò)程中PcG蛋白的作用研究

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【摘要】：背景:皮膚老化是人體衰老的重要標(biāo)志之一,除內(nèi)源性自然衰老外,外源性環(huán)境也可致人類皮膚老化的發(fā)生。其中長(zhǎng)波紫外線(ultraviolet a,UVA)輻射是引起皮膚老化的最主要外源性因素,該過(guò)程也稱為皮膚光老化。長(zhǎng)時(shí)間的紫外線輻射不僅加速皮膚的老化進(jìn)程,還可導(dǎo)致斑點(diǎn)色素沉著、毛細(xì)血管擴(kuò)張、光老化性紫癜、甚至癌前病變等病理改變。目前光老化的治療方法主要包括維甲酸外用、肉毒素注射、軟組織填充、激光治療等,皮膚狀態(tài)可得到一定改善,但由于光老化機(jī)制不清,這些治療方法很難從根本上達(dá)到延緩皮膚老化的作用。Pc G(Polycomb group)復(fù)合體是一種染色質(zhì)修飾蛋白,控制個(gè)體正確的發(fā)育模式。Pc G不僅與細(xì)胞分化增殖和腫瘤發(fā)生等過(guò)程密切相關(guān),并且參與機(jī)體和細(xì)胞衰老的表觀調(diào)控。在Pc G家族復(fù)合物中,多梳復(fù)合體2(polycomb repressivecomplex2,PRC2)的亞基E(z)/EZH2起著核心作用,參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成、基因表達(dá)調(diào)控以及DNA損傷等多種分子機(jī)制過(guò)程。EZH2具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性,可催化組蛋白H3和H4的N端賴氨酸或者精氨酸殘基發(fā)生甲基化,從而通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白甲基化修飾過(guò)程表觀調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和腫瘤發(fā)生。然而針對(duì)光老化的表觀遺傳學(xué)研究目前鮮見(jiàn)報(bào)道,我們課題組前期發(fā)現(xiàn)皮膚光老化過(guò)程中Pc G家族復(fù)合物可能參與了透明質(zhì)酸的合成調(diào)控,因而Pc G復(fù)合物可能是皮膚光老化過(guò)程中的一個(gè)重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控分子。目的:探討UVA輻射誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞損傷衰老過(guò)程中Pc G蛋白復(fù)合體對(duì)透明質(zhì)酸合成代謝及透明質(zhì)酸參與的分子信號(hào)通路相關(guān)靶基因的調(diào)控作用,為進(jìn)一步闡明皮膚光老化過(guò)程中Pc G家族的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制提供堅(jiān)實(shí)理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法:本實(shí)驗(yàn)以人皮膚成纖維(human skin fibroblast,HSF)細(xì)胞作為研究對(duì)象,利用長(zhǎng)波紫外線輻射人皮膚成纖維細(xì)胞構(gòu)建紫外線輻射誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞損傷模型。1.探究UVA輻射對(duì)成纖維細(xì)胞表型的影響以及EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑GSK126對(duì)UVA輻射誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表型改變的作用:我們采用細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色觀察了不同劑量UVA輻射對(duì)成纖維細(xì)胞衰老的影響及EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑GSK126對(duì)UVA輻射介導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老改變的影響;采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(cell-counting kit 8,CCK8)檢測(cè)了不同劑量UVA輻射對(duì)成纖維細(xì)胞增殖活性的影響及GSK126對(duì)UVA輻射介導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖活性改變的影響;采用細(xì)胞凋亡-Hoechst染色及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)了GSK126對(duì)UVA輻射介導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡改變的影響;采用紅細(xì)胞顆粒排阻實(shí)驗(yàn)觀察不同劑量UVA輻射對(duì)成纖維細(xì)胞周圍透明質(zhì)酸含量的影響及GSK126對(duì)UVA輻射介導(dǎo)成纖維細(xì)胞周圍透明質(zhì)酸含量改變的影響。2.UVA輻射誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老及GSK126抗成纖維細(xì)胞衰老機(jī)理初步探討—相關(guān)分子轉(zhuǎn)錄水平的變化:我們采用實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)(realtime-polymerase chain reaction,RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)不同劑量UVA輻射對(duì)Pc G關(guān)鍵基因、HA合成代謝相關(guān)基因及HA參加的信號(hào)通路分子相關(guān)基因表達(dá)的影響;并檢測(cè)了GSK126對(duì)UVA輻射誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老模型中以上相關(guān)基因的表達(dá)變化。3.UVA輻射誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老及GSK126抗成纖維細(xì)胞衰老機(jī)理初步探討—相關(guān)分子翻譯水平的變化:我們采用SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)了UVA輻射及GSK126對(duì)Pc G家族關(guān)鍵亞基EZH2、HA合成系統(tǒng)及組蛋白H3K27me3的蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.不同劑量UVA輻射對(duì)成纖維細(xì)胞表型的影響及EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶抑制GSK126對(duì)UVA輻射誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表型變化的影響:β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示與對(duì)照組相比5J/cm2、10J/cm2大劑量UVA輻射可明顯誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老的發(fā)生,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),10J/cm2UVA輻射后成纖維細(xì)胞衰老比例最高;CCK8增殖活性檢測(cè)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比不同劑量UVA(2.5J/cm2、5J/cm2、10J/cm2)輻射成纖維細(xì)胞后,細(xì)胞增殖活性均逐漸下降,10J/cm2UVA輻射劑量能明顯抑制成纖維細(xì)胞增殖活性,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);紅細(xì)胞排阻實(shí)驗(yàn)顯示與對(duì)照組相比,5J/cm2、10J/cm2UVA輻射成纖維細(xì)胞后,HSF細(xì)胞對(duì)周圍紅細(xì)胞產(chǎn)生的空間排阻作用減輕,10J/cm2 UVA輻射HSF細(xì)胞后對(duì)紅細(xì)胞的空間排阻作用基本消失。β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示對(duì)照組(10J/cm2)相比,GSK126可明顯降低UVA輻射所致成纖維細(xì)胞衰老比例,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);CCK8增殖活性檢測(cè)結(jié)果顯示與對(duì)照組(10J/cm2)相比GSK126的加入使細(xì)胞增殖活性逐漸增加,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);Hoeschst凋亡染色與流式結(jié)果顯示與對(duì)照組(10J/cm2)相比,GSK126可顯著抑制UVA所致成纖維細(xì)胞凋亡的發(fā)生,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);紅細(xì)胞排阻實(shí)驗(yàn)顯示與對(duì)照組相比(0J/cm2、5J/cm2、10J/cm2),GSK126可相應(yīng)增強(qiáng)各對(duì)照成纖維細(xì)胞對(duì)紅細(xì)胞外排效應(yīng)。2.不同劑量UVA輻射及EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑GSK126對(duì)成纖維細(xì)胞對(duì)Pc G關(guān)鍵基因、HA合成代謝相關(guān)基因及HA參加的信號(hào)通路分子相關(guān)基因表達(dá)的影響:PT-PCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,不同劑量UVA輻射成纖維細(xì)胞后Pc G關(guān)鍵基因EZH2及BMI-1、HA系統(tǒng)相關(guān)基因、HA參與相關(guān)信號(hào)通路相關(guān)分子基因表達(dá)均于12h出現(xiàn)上調(diào)改變,24h出現(xiàn)不同程度下降趨勢(shì),其中10J/cm2UVA輻射組多有基因改變均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),2.5J/cm2、5J/cm2劑量組部分改變具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑GSK126可促使UVA輻射所致HAS2、HAS3、CD44、P16、BMI-1基因上調(diào)進(jìn)一步升高,下調(diào)UVA輻射所致MMP-1基因的升高,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.UVA輻射及GSK126對(duì)成纖維細(xì)胞中EZH2、HAS1、HAS2、HAS3、H3K27me3蛋白表達(dá)的影響:UVA輻射成纖維細(xì)胞后,H3K27me3、HAS3蛋白表達(dá)水平升高,HAS2、EZH2蛋白表達(dá)水平下降;EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑GSK126降低成纖維細(xì)胞中(正常組與UVA輻射組)H3K27me3、EZH2蛋白水平的同時(shí),增加HAS2、HAS3蛋白表達(dá)。結(jié)論:1.不同劑量UVA輻射成纖維細(xì)胞后,可不同程度誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老、降低細(xì)胞增殖活性、減少成纖維細(xì)胞周透明質(zhì)酸含量,10J/cm2劑量輻射組,成纖維細(xì)胞表型發(fā)生明顯改變。2.不同劑量UVA輻射成纖維細(xì)胞后HA合成代謝系統(tǒng)(HAS1、HAS2、HAS3、CD44、Hyal-1、Hyal-2)、HA參與相關(guān)調(diào)控通路分子(EGF/EGFR、Smad2/Smad4、P16、MMP-1)及Pc G蛋白復(fù)合體關(guān)鍵分子(EZH2、BMI-1)基因表達(dá)于12h明顯上調(diào),24h后呈現(xiàn)一定下調(diào)趨勢(shì)。3.我們首次觀察到EZH2甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑GSK126可減少UVA輻射誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老程度,提高UVA輻射損傷衰老細(xì)胞模型的增殖活性,減少其凋亡比例,增加其周圍透明質(zhì)酸含量,改變UVA輻射損傷誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老表型。4.同時(shí)我們亦首次研究探討了組蛋白修飾對(duì)HA的表達(dá)影響,我們發(fā)現(xiàn)抑制H3K-27me3后,在轉(zhuǎn)錄水平上課上調(diào)HAS2、HAS3、CD44及P16基因的表達(dá),同時(shí)下調(diào)MMP-1基因的表達(dá)。在蛋白水平上調(diào)HAS2、HAS3的表達(dá)。以上結(jié)果提示:Pc G家族可通過(guò)組蛋白H3K27me3修飾調(diào)控HA的表達(dá),特別是HAS2、HAS3仍需要進(jìn)行Chip-sequence等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)EZH2、H3K27-me3與以上關(guān)鍵基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合,為HA的組蛋白修飾調(diào)控作用研究積累科學(xué)基礎(chǔ)。同時(shí)我們也期望可以從天然植物單體庫(kù)中篩選出GSK126類似小分子化合物,通過(guò)抑制H3K27me3水平,保護(hù)紫外輻射所致皮膚損傷,開發(fā)一種皮膚光老化天然保護(hù)劑。
【關(guān)鍵詞】：光老化 多梳蛋白 長(zhǎng)波紫外線 成纖維細(xì)胞 EZH2
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R818
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-16
• 英文縮寫一覽表16-18
• 第1章 緒論18-26
• 1.1 皮膚老化18
• 1.2 皮膚光老化過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)改變18-20
• 1.2.1 膠原蛋白19
• 1.2.2 透明質(zhì)酸19-20
• 1.3 成纖維細(xì)胞光老化過(guò)程中相關(guān)分子及信號(hào)通路20-24
• 1.3.1 16~(INK4a)/Rb細(xì)胞衰老、永生化信號(hào)途徑：20
• 1.3.2 MAPK級(jí)聯(lián)分子信號(hào)通路20-21
• 1.3.3 TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路21-22
• 1.3.4 ROS氧化應(yīng)激通路22-23
• 1.3.5 CD44-EGFR-ERK共定位信號(hào)系統(tǒng)影響成纖維細(xì)胞表型23-24
• 1.4 PCG與表觀遺傳學(xué)24-26
• 第2章 實(shí)驗(yàn)方法26-37
• 2.1 材料和儀器26-28
• 2.1.1 主要試劑26-27
• 2.1.2 主要儀器27-28
• 2.1.3 主要耗材28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-37
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、接種及UVA輻射28-29
• 2.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK8）29
• 2.2.3 細(xì)胞凋亡-Hoechst染色29
• 2.2.4 細(xì)胞凋亡-流式檢測(cè)29-30
• 2.2.5 細(xì)胞衰老 β-半乳糖苷酶染色30
• 2.2.6 紅細(xì)胞排阻實(shí)驗(yàn)30-31
• 2.2.7 實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)31-34
• 2.2.8 SDS-PAGE凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳）34-37
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-49
• 3.1 不同劑量UVA輻射對(duì)成纖維細(xì)胞表型的影響37-39
• 3.2 不同劑量UVA輻射對(duì)成纖維細(xì)胞中PCG家族關(guān)鍵基因、HA合成代謝相關(guān)基因及HA參與的信號(hào)通路關(guān)鍵分子基因表達(dá)的影響39-42
• 3.3 成纖維細(xì)胞中EZH2甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑GSK126的IC50測(cè)定42
• 3.4 GSK126對(duì)UVA輻射誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞損傷過(guò)程中細(xì)胞表型變化的影響42-45
• 3.5 GSK126對(duì)UVA輻射誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞損傷過(guò)程中PCG家族關(guān)鍵基因、HA合成代謝相關(guān)基因及HA參與的信號(hào)通路關(guān)鍵分子基因表達(dá)改變的影響45-49
• 第4章 討論49-54
• 第5章 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-62
• 作者簡(jiǎn)介及在學(xué)期間所取得的科研成果62-64
• 致謝64

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6 張誠(chéng)s，

本文編號(hào)：662426