本文關(guān)鍵詞：多巴胺誘導(dǎo)大鼠原代培養(yǎng)杏仁核神經(jīng)元凋亡

  更多相關(guān)文章： 多巴胺 多巴胺D1受體 杏仁核神經(jīng)元 Bax TUNEL 凋亡

【摘要】：目的:在法醫(yī)檢案中可遇到非致命性機(jī)械性損傷如長時間限制體位、肢體被壓迫后一段時間出現(xiàn)精神損傷甚至死亡的案件。由于此類損傷程度輕微,甚至沒有明顯的肉眼可見的外傷,因而此類案件的鑒定工作已經(jīng)成為法醫(yī)工作者面臨的難題。分析此類案件的發(fā)生發(fā)展過程,不難發(fā)現(xiàn)這些案件均存在共同的特點即當(dāng)事人產(chǎn)生不同程度的心理應(yīng)激。研究已經(jīng)證實,過度而持久的心理應(yīng)激可以引起精神損傷,但具體的分子機(jī)制尚不明確。研究這一科學(xué)問題對于解決此類案件的鑒定工作具有非常重要的科學(xué)意義。應(yīng)激是機(jī)體對各種應(yīng)激原所作出一種適應(yīng)性反應(yīng)。其神經(jīng)-內(nèi)分泌反應(yīng)主要表現(xiàn)為藍(lán)斑-交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)的激活,使兒茶酚胺(catecholamine,CA)、糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)、胰高血糖素等應(yīng)激相關(guān)激素的水平快速升高,來保證重要生命器官的功能和代謝,具有重要的防御代償意義。但應(yīng)激激素長時間維持高水平,可引起氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡等多種病理過程,這使應(yīng)激的防御代償意義轉(zhuǎn)變?yōu)閷C(jī)體的損傷。CA是應(yīng)激過程中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的主要激素之一。研究CA對機(jī)體的損傷作用對于闡明應(yīng)激性損害的機(jī)制具有重要意義。多巴胺(dopamine,DA)作為CA的一種,在腦內(nèi)有著廣泛的分布,是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì),在調(diào)節(jié)運(yùn)動、獎賞、學(xué)習(xí)、記憶以及情緒方面起著關(guān)鍵作用。越來越多的研究表明,多巴胺系統(tǒng)在應(yīng)激引起的精神損傷中發(fā)揮重要作用,如精神分裂癥、重性抑郁障礙等。因此研究多巴胺對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷作用將為闡明心理應(yīng)激導(dǎo)致精神損傷的機(jī)制提供理論依據(jù)。近年來,對于杏仁核的研究越來越多,并且逐漸意識到其在應(yīng)激過程中可能也發(fā)揮著重要作用。杏仁核屬于邊緣系統(tǒng)的一部分,附著在海馬的末端,與皮層、海馬、下丘腦、腦干、嗅球等都有廣泛的聯(lián)系。杏仁核在恐懼、焦慮形成中發(fā)揮著重要作用,是對恐懼刺激做出反應(yīng)的主要中樞�；加袆�(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(post-traumatic stress disorder,PTSD)的病人,杏仁核體積變小,并且在PTSD動物模型中,觀察到杏仁核神經(jīng)元損傷[5]。研究表明人杏仁核中有豐富的多巴胺D1和D2受體分布,在應(yīng)激狀態(tài)下杏仁核多巴胺釋放增加,且多巴胺D1受體和多種神經(jīng)心理疾病有關(guān)系。但對于多巴胺是否能引起杏仁核神經(jīng)元凋亡目前尚不清楚�；谝陨媳尘�,本實驗將在細(xì)胞水平探討多巴胺是否可通過多巴胺D1受體誘導(dǎo)杏仁核神經(jīng)元發(fā)生凋亡,從而為闡明心理應(yīng)激導(dǎo)致精神障礙的機(jī)制提供一定實驗依據(jù)。方法:1原代培養(yǎng)大鼠杏仁核神經(jīng)元,應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法對神經(jīng)元純度進(jìn)行鑒定。2通過MTS細(xì)胞增殖分析實驗評價不同濃度多巴胺(10μM、30μM、50μM、100μM、150μM)對杏仁核神經(jīng)元細(xì)胞存活率的影響,確定最佳濃度后,選取該濃度作用杏仁核神經(jīng)元不同時間(24h、48h、72h),采用MTS實驗評價不同作用時間對杏仁核神經(jīng)元存活率的影響。3用DA處理杏仁核神經(jīng)元后,免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法觀察Bax蛋白轉(zhuǎn)移情況,探討DA處理后杏仁核神經(jīng)元是否發(fā)生凋亡現(xiàn)象。4為了進(jìn)一步證實DA是否導(dǎo)致了杏仁核神經(jīng)元的凋亡,本實驗采用DA(50μM)與DA1受體拮抗劑中文SCH-23390共同孵育神經(jīng)元。實驗分為四組:對照組、DA組、DA+SCH-23390組、SCH-23390組,作用48h后,用Real-time PCR技術(shù)檢測各組促凋亡基因Bax m RNA的表達(dá)情況;采用TUNEL技術(shù)原位檢測各組TUNEL陽性細(xì)胞率;采用Western blot技術(shù)比較各組ATF-6蛋白的表達(dá)水平情況。5數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示,用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA),用最小顯著差法Tamhane’S T2作兩兩比較,以P0.05為有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果:1神經(jīng)元原代培養(yǎng)結(jié)果:培養(yǎng)8-10天后,神經(jīng)元胞體較小,胞核大而圓,突觸細(xì)長、交織成網(wǎng)狀,符合成熟神經(jīng)元的特征。神經(jīng)元胞體的特異性標(biāo)記物MAP-2對神經(jīng)元進(jìn)行免疫熒光染色,結(jié)果顯示原代培養(yǎng)神經(jīng)元純度"g90%,可用于后續(xù)實驗。2多巴胺對杏仁核神經(jīng)元存活率的影響(1)MTS篩選杏仁核神經(jīng)元數(shù)量結(jié)果實驗結(jié)果顯示,杏仁核神經(jīng)元數(shù)量與490nm處吸光度值呈線性相關(guān),其相關(guān)性達(dá)R2=0.98916。為使MTS結(jié)果更準(zhǔn)確,將吸光度值選取在0.8-0.9左右,此時96孔板選取細(xì)胞數(shù)為20000cells/well。(2)不同濃度DA對杏仁核神經(jīng)元存活率的影響與對照組相比,50μM、100μM、150μM濃度的DA作用神經(jīng)元48h后,杏仁核神經(jīng)元存活率明顯降低(P0.05),且呈濃度依賴性;10μM、30μM的DA對神經(jīng)元存活率沒有明顯影響(P0.05)。因而將50μM作為DA導(dǎo)致杏仁核神經(jīng)元存活率降低的最低敏感濃度進(jìn)行時間依賴性檢測。(3)DA作用不同時間(24h、48h、72h)對杏仁核神經(jīng)元存活率的影響與對照組相比,50μM DA作用48h、72后,杏仁核神經(jīng)元存活率明顯降低(P0.05);作用24h時,杏仁核神經(jīng)元存活率沒有明顯變化(P0.05)。因此選取50μM的DA作用于杏仁核神經(jīng)元48h作為后續(xù)實驗處理條件。3杏仁核神經(jīng)元Bax蛋白轉(zhuǎn)移情況結(jié)果:在DA處理后,通過免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色,觀察到Bax蛋白轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核的現(xiàn)象,提示DA可能誘導(dǎo)杏仁核神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。4 RT-PCR檢測杏仁核神經(jīng)元Bax m RNA表達(dá)結(jié)果:與對照組相比,DA組Bax m RNA的表達(dá)水平明顯增高(P0.05);而DA+SCH-23390組相比于DA組,Bax m RNA的表達(dá)水平明顯降低(P0.05),說明DA可以誘導(dǎo)杏仁核神經(jīng)元凋亡,且多巴胺D1受體參與了凋亡誘導(dǎo)過程。5 TUNEL檢測杏仁核神經(jīng)元凋亡結(jié)果與對照組相比,DA處理后,TUNEL陽性細(xì)胞率明顯增加(P0.05)。與DA組相比,用DA+SCH-23390共同處理后,TUNEL陽性細(xì)胞率明顯降低(P0.05),結(jié)合Bax m RNA表達(dá)的檢測結(jié)果,進(jìn)一步說明DA可以通過D1受體誘導(dǎo)杏仁核神經(jīng)元凋亡。6 Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白ATF-6的表達(dá)結(jié)果與對照組比較,DA組ATF-6蛋白表達(dá)水平明顯增高(P0.05);與DA組相比,DA+SCH-23390組ATF-6蛋白表達(dá)水平明顯降低(P0.05)。說明DA誘導(dǎo)杏仁核神經(jīng)元的凋亡過程可能有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的參與。結(jié)論:多巴胺可以通過多巴胺D1受體誘導(dǎo)大鼠原代培養(yǎng)杏仁核神經(jīng)元凋亡。
【關(guān)鍵詞】：多巴胺 多巴胺D1受體 杏仁核神經(jīng)元 Bax TUNEL 凋亡
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：D919
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-16
• 材料與方法16-26
• 結(jié)果26-28
• 附圖28-38
• 附表38-41
• 討論41-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 綜述 多巴胺在焦慮樣行為中的調(diào)節(jié)作用49-61
• 參考文獻(xiàn)54-61
• 致謝61-62
• 個人簡歷62

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