本文關鍵詞：可用以評價子宮內膜容受性的KDR單抗脂質聲學造影劑的制備及靶向結合實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景與目的 子宮內膜容受性是指子宮內膜處于一種允許胚泡黏附直至完成胚胎著床的狀態(tài)。在月經周期中子宮內膜僅有一段時間允許胚胎著床,一般為黃體中晚期,其受嚴格的時間和空間限制,一般僅為排卵后的6-8天,持續(xù)不到48小時,臨床上也稱為子宮內膜“種植窗”期。體外受精-胚胎移植(in vitrofertilization-embryo transfer, IVF-ET)技術為不孕癥患者提供了福音,但在臨床實際工作中,即使應用相當高的技術篩選了相對優(yōu)質的受精卵,即體外受精及胚泡移植入子宮的成功率在90%以上,但胚胎種植的成功率一般僅為30%-40%。有研究表明60%以上胚胎種植失敗的因素歸因于不合適的子宮內膜容受性。如何客觀評價“種植窗”期子宮內膜容受性,避免盲目移植,以提高胚胎著床率是生殖醫(yī)學界關注的熱點問題之一。 現階段評價子宮內膜容受性的方法有多種,子宮內膜活檢隨后進行組織及相關生物學指標的測定是臨床較公認的評估方法,但其為有創(chuàng)性檢查,在IVF-ET周期中不具可操作性。宮腔灌洗液、宮頸粘液生物標記物的測定,血液特殊激素表達測定及基因標記現階段也有應用,但缺乏相應準確而又敏感的指標或價格昂貴、技術要求較高。彩色多普勒超聲技術可作為一種無創(chuàng)手段測定子宮血流灌注情況來評價子宮內膜容受性,但其敏感性、特異性學術界尚存在爭議。尋找一種既無創(chuàng)、又能客觀評價子宮內膜容受性的方法以提高胚胎種植率是一個亟待解決的問題。 Kodaman等多位學者證實,多種細胞因子和生長因子在黃體中晚期短暫、瞬間性高表達,具有顯著的時空表達特征,且定位較專一,參與胚胎著床過程,如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，，VEGF)、白血病抑制因子、整合素、白細胞介素、表皮生長因子等。在受精卵著床、胚胎植入過程中,血管的成熟無疑是最重要的,VEGF是子宮血管發(fā)育重要的調節(jié)因子之一。Kaczmarek等研究發(fā)現,動物“種植窗”期子宮內膜VEGF及其受體flk-1/KDR均顯著上調,且VEGF及其受體的表達部位存在從子宮內膜普遍表達到著床位點局部高表達的轉變,提示VEGF可作為植入胚胎與接受狀態(tài)子宮內膜的血管結構之間的局部信號分子。Hwu YM等證實VEGF與受體flk-1/KDR結合后發(fā)揮多種生物學功能,以利于胚胎著床,如血管內皮細胞增殖、血管生成、增加血管通透性、介導信號轉導、改變內皮細胞基因的表達、調節(jié)子宮內膜生長等�！胺N植窗”期子宮內膜VEGF及其受體flk-1/KDR表達均顯著增加,表達定位于上皮細胞、基質細胞、子宮肌層和血管內皮細胞,以促進血管生成、重構、擴張以及增加血管通透性,這一過程是胚胎成功種植的必要條件。Sengupta等證明于排卵后5-10天給予恒河猴VEGF拮抗劑后,其臨床妊娠率較對照組顯著下降。以上實驗表明VEGF及受體KDR的表達水平對評價子宮內膜容受性具有重要意義。 靶向超聲造影劑是近年來萌芽的一項新興研究領域,并逐漸成為國際上探討的熱點課題。靶向超聲微泡表面攜帶的特異性抗體或配體能與靶細胞表面的抗原或受體結合,超聲檢測靶向造影劑在組織和器官中的分布,可獲得組織和器官的分子學特征,稱之為“超聲分子學成像”,是一種無創(chuàng)檢測分子水平的成像技術,其在炎癥、血栓、心肌缺血、腫瘤等諸多方面均展示了一些十分誘人的前景。以子宮內膜血管組織的KDR為靶點進行靶向特異性顯影而評價子宮內膜容受性的研究,國內外尚未見報道。 本研究擬利用超聲分子影像學優(yōu)勢,以KDR為靶目標,借助生物素-親和素橋,制備攜KDR單抗的靶向超聲造影劑(Microbubblles-Biotin-Avidin-Biotin-KDR, MB-BAB-KDR),并通過體內外的靶向結合實驗來探討其在評價子宮內膜容受性中的價值。材料與方法 1MB-BAB-KDR的制備及生物活性測定 1.1普通生物素化脂質微泡(MB-B)的制備 將生物素化二硬脂酞磷脂酞乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG-2000-Biotin)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DistearoylsnGlyeeroPhosPhoethanola, DPPC)、聚乙二醇-4000(PEG-4000)、泊洛沙姆等材料,參照文獻,按一定比例溶于蒸餾水中,在75℃恒溫水浴箱上搖勻使其充分溶解；通入全氟丙烷(C3F8)氣體,機械振蕩法振蕩至成為乳白色液體；4℃度靜置分層,棄下清液,純化微泡三次收集上層白色微泡,制得MB-B。 1.2生物素-親和素橋連的靶向脂質微泡(MB-BAB-KDR)及單純單抗脂質微泡(MB-B-KDR)制備 按一定比例向MB-B中加入親和素,冰上孵育30min,洗滌純化3次后,再加入一定比例的生物素化KDR單抗,靜置后洗滌純化3次,制得生物素-親和素橋連的靶向脂質微泡MB-BAB-KDR。向MB-B中直接加入相同比例的生物素化KDR單抗,靜置后洗滌純化3次,制得單純單抗脂質微泡MB-B-KDR。所有微泡盛于安剖瓶內,于4℃冰箱內保存、備用。1.3光學顯微鏡及庫爾特粒徑分析儀測定微泡物理性質 將載玻片及蓋玻片擦拭干凈,輕輕用注射器將微泡懸液吸出少許,滴在載玻片中央,并將蓋玻片蓋在載玻片上；使懸液充滿蓋玻片和載玻片之間,倒置并靜置3min,使其靠浮力作用附于載玻片上；普通光學顯微鏡下觀察微泡的鏡下形態(tài)。另外用注射器吸取MB-B、MB-B-KDR、MB-BAB-KDR三種微泡懸浮溶液各1ml,以1：10000比例稀釋,取2ml微泡上機,庫爾特顆粒粒度分析儀測定微泡粒徑、濃度及粒徑分布情況。 1.4MB-BAB-KDR生物活性的測定 分別取MB-BAB-KDR、MB-B-KDR、MB-B各lml與等量FITC標記的羊抗大鼠IgG(H+L)(簡稱二抗)孵育,洗滌純化3次后,熒光顯微鏡下觀察三種微泡與二抗的結合情況。依據以下目測標準對熒光強度進行分級：0級：未見明顯熒光；Ⅰ級：可見到熒光,但熒光微弱或暗淡；Ⅱ級：可見明亮熒光。 2MB-BAB-KDR的體外特異性結合及黏附穩(wěn)定性實驗 2.1臍靜脈內皮細胞(IUVECs)KDR的表達檢測 2.1.1流式細胞實驗法檢測HUVECs的KDR表達 將由南方醫(yī)科大學病理實驗室提供的HUVECs復蘇、培養(yǎng),取生長對數期的HUVECs,用0.25%胰酶消化成單細胞懸液加入離心管中,離心棄上清液并洗滌1次；加入稀釋的KDR單克隆抗體200μl吹打混勻,置4℃孵育30min,離心洗滌棄上清液3次；再加入FITC標記的二抗200μl,吹打混勻,4℃避光孵育30min,離心洗滌棄上清液3次；將細胞重新懸浮于500ul蒸餾水中,置流式管中應用流式細胞儀檢測HUVECs的KDR表達情況,以同等量的HUVECs懸浮為對照組。 2.1.2免疫組化法檢測HUVECs的KDR表達 取生長對數期HUVECs,用0.25%胰酶消化后,接種于6孔板中玻片上,加含10%胎牛血清DMEM全培液,5%C02培養(yǎng)箱孵育,直至細胞80%飽和,PBS洗滌3次,4%多聚甲醛固定,行常規(guī)KDR免疫熒光檢測。2.2MB-BAB-KDR與HUVECs的體外特異性結合實驗 用熒光染料DiI給生長良好的傳代]SUVECs著色,著色細胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)至下一代細胞,在六孔板中培養(yǎng)制作細胞爬片,分別用MB-BAB-KDR、 MB-B-KDR、MB-B與爬片上的HUVECs孵育30min,漂洗六次,光鏡及熒光顯微鏡觀察微泡與細胞結合情況。取10個隨機視野的細胞進行觀察,每個細胞結合5個或以上的微泡視為花環(huán)形成陽性,熒光顯微鏡下觀察花環(huán)形成情況,計算花環(huán)形成率,計數資料以百分率表示。同時用MB-BAB-KDR、MB-B-KDR、MB-B分別與無DiI染色的HUVECs孵育作對照,光鏡下計數成環(huán)率。 2.3平行板流動腔法檢測MB-BAB-KDR的體外黏附穩(wěn)定性 35mm培養(yǎng)皿甲醇漂洗后風干、備用。用PBS溶液分別配備1000ng/ml、600ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、10ng/ml的小鼠KDR Fc溶液,用微量加樣槍按200μl滴加在培養(yǎng)皿中央,置4℃冰箱過夜備用；次晨使用前用0.05%的吐溫20沖洗6遍,3%的TBS-小牛血清白蛋白液封閉1h。將包被好的培養(yǎng)皿與平行板流動腔裝置連接,在1.2dyn/cm2剪切應力下,濃度為5×106個/ml的MB-BAB-KDR經微量注射泵通過平行板流動腔,自顯微鏡下觀察有微泡出現后開始連續(xù)錄像6min。以10OOng/ml KDR Fc包被+大量抗小鼠KDR單抗封閉(封閉組)和Ong/ml KDR Fc包被(空白組)為對照。所有分組均檢測3個樣本。25幀/s的視頻采集后,利用IPP (Image-Pro-Plus)圖像分析軟件的圖像均化及自動跟蹤功能,在細胞計數板的協(xié)助下測量不同濃度視野內于整分鐘點結合的MB-BAB-KDR個數。 3MB-BAB-KDR與小鼠子宮血管內皮細胞的KDR體內靶向結合初步實驗 3.1小鼠模型的制備 KM雌性小鼠(由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供)2只(8-10周齡,重約30g),1只異氟烷麻醉后解剖,將小鼠子宮暴露,對小鼠子宮位置及形態(tài)了解,另1只利用VEVO2100高頻超聲生物儀,40MHz高頻探頭對小鼠子宮行常規(guī)二維超聲成像,為后期小鼠子宮分子成像提供解剖基礎。另取KM小鼠18只(雌性15只,雄性3只,8-10周齡,重約30g),將健康成年雌雄小鼠按2：1于前一晚20：00合籠,自由飲食和飲水,室溫25℃左右,次日晨檢查陰栓形成情況。 根據雌性小鼠被檢查到陰栓的時間進行分組,檢查到有陰栓為受孕第一天定義為day-1(D1),其余妊娠天數類推,分別制備day-2(D2)組、day-4(D4)組小鼠,將沒有合籠的雌性小鼠定義為day-0(DO)組。三個組的小鼠子宮為研究對象,每組各5只。 3.2MB-BAB-KDR與小鼠子宮血管內皮細胞的靶向結合實驗 用異氟烷將不同子宮容受性的小鼠麻醉,經尾靜脈隨機注射MB-BAB-KDR或對照微泡(MB-B)后,用VEVO2100小、動物超聲成像儀,40MHz高頻探頭,進行小鼠子宮成像。每只小鼠經尾靜脈注射靶向微泡(MB-BAB-KDR)和普通微泡(MB-B)各5×107個,兩種微泡注射順序隨機,兩次造影之間間隔30min。于每次注射微泡4min后,先采集200幀圖像,然后觸發(fā)burst序列(transmit power,100%; mechanical index,0.63) ls,再采集200幀。用觸發(fā)burst前后的圖像進行減影,得到的信號即為粘附的靶向微泡的信號,將其用綠色偽彩標示。整個實驗過程中保持動物及探頭的位置固定不變。依據偽彩顏色的明顯程度對靶向吸附微泡數進行半定量分析。以下目測標準對造影偽彩綠色強弱進行分級：0級：未見明顯綠色,即減影前后,圖像無明顯差別,靶向微泡沒有或較少吸附,無法顯示；Ⅰ級：可見到綠色,但綠色較少,為星點狀分布；Ⅱ級：綠色較為明顯,且綠色范圍較多,呈小片狀分布,即減影前后差別較大,靶向吸附微泡數目較多。 3.3免疫熒光法檢測小鼠子宮血管內皮細胞KDR的表達 分別取D0,D2,D4時期的小鼠子宮制作冰凍切片,用免疫熒光法分別對其KDR的表達情況進行檢測。同時為了形象觀察小鼠子宮血管內皮細胞上的KDR的表達,應用帶有綠色熒光的CD31對小鼠子宮血管內皮細胞進行標示。熒光顯微鏡下觀察小鼠子宮血管內皮細胞及其上的KDR的著色情況,依據以下目測標準對紅色熒光標記的KDR進行分級：陰性：未見明顯紅色熒光,弱陽性：可見到紅色熒光,但熒光微弱或暗淡,陽性：可見較明亮紅色的熒光。帶綠色熒光CD31標記的血管內皮細胞的分級為：陰性：未見明顯綠色熒光；弱陽性：可見到綠色熒光,但熒光微弱或暗淡,規(guī)律性一般,未見明顯管條狀分布；陽性：可見較明亮綠色的熒光,且排列規(guī)律,呈管條狀分布,即血管形成,血管內皮細胞排列規(guī)律。 4統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析,計量資料數據以均數±標準差(Mean±SD)表示。MB-B、MB-BAB-KDR及NMB-B-KDR三種微泡粒徑之間的比較采用單向方差分析,計數資料成環(huán)率采用百分率表示,數據比較采用多個獨立樣本比較的非參數秩和檢驗；平行板流動腔實驗穩(wěn)定結合的靶泡數目之間采用一個重復測量兩因素方差分析。免疫熒光法測得的MB-BAB-KDR上單抗的生物活性、MB-BAB-KDR在小鼠子宮的靶向超聲分子顯影采用半定量分析方法。檢驗水準以P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。結果 1MB-BAB-KDR的制備及性能測定 1.1三種微泡基本物理性能 MB-B、MB-BAB-KDR及NMB-B-KDR的懸浮液外觀呈乳白色,在200倍光學顯微鏡下觀察,微泡粒徑分布均勻無聚集現象,單個微泡外觀圓整,為透亮氣泡。庫爾特粒徑分析儀測得MB-B的平均直徑約(2.19±1.35)μm,濃度約9.8×108個/ml；MB-BAB-KDR平均直徑為(2.42±1.71)μm,濃度約為9.6×108個/ml；MB-B-KDR平均直徑為(2.38±1.60)u m,濃度約為9.6×108個/ml。三種微泡的外觀、形態(tài)均未見明顯差別,粒徑大小差異無統(tǒng)計學意義。 1.2MB-BAB-KDR生物活性的測定 與熒光二抗孵育后,MB-BAB-KDR的熒光強度為Ⅱ級,MB-B-KDR熒光強度為Ⅰ級,MB-B熒光強度為0級。 2MB-BAB-KDR的體外特異性結合及黏附穩(wěn)定性實驗 2.1HUVECs KDR表達的測定 流式細胞儀測得HUVECs的FITC攜帶率達99%,即所使用的HUVECs的KDR為高表達狀態(tài)。免疫熒光實驗顯示HUVECs的KDR呈強陽性表達,陽性物質定位于細胞膜及胞漿內。 2.2MB-BAB-KDR與HUVECs體外靶向特異結合情況 光鏡下可見MB-BAB-KDR圍繞在有或無DiI染色的HUVECs周圍或黏附于其之上,形成花環(huán)樣結構,有DiI染色的HUVECs花環(huán)形成率平均為89.97%,無DiI染色的HUVECs花環(huán)形成率平均為88.22%。熒光鏡下被DiI染色的細胞發(fā)出明亮的紅色熒光,黏附于細胞周圍的被FITC標記的MB-BAB-KDR外殼發(fā)出明亮的綠色熒光,用Nikon成像系統(tǒng)里面的重疊軟件重合圖片,可清晰看到細胞周圍靶向微泡吸附。MB-B-KDR組成環(huán)率為7.25%,MB-B組的成環(huán)率為3.33%,均顯著低于MB-BAB-KDR組,P0.005。 2.3平行板流動腔實驗檢測MB-BAB-KDR的黏附穩(wěn)定性實驗 平行板流動腔實驗顯示在血流剪切應力為1.2dyn/cm2下,MB-BAB-KDR可與濃度為1000ng/ml、600ng/ml、200ng/ml、100ng/ml、10ng/ml的KDR Fc包被結合,所錄視頻經IPP軟件處理,穩(wěn)定黏附的MB-BAB-KDR與移動的MB-BAB-KDR將被區(qū)別。MB-BAB-KDR經過不同濃度KDR Fc包被的平行板流動腔,重復測量方差分析顯示,觀察6min內,MB-BAB-KDR結合數目隨著平行板流動腔上KDR Fc包被濃度的提高而增加(F=571.926,P0.01)；在同一濃度下,隨著時間的推移,MB-BAB-KDR結合數目也在增加。MB-BAB-KDR幾乎不能與空白培養(yǎng)皿及被抗小鼠KDR單抗封閉掉位點的KDR Fc結合,在整個6min時間段內,結合總數僅為3-5個,且不同時間點結合在視野不同地方,即為隨機結合且不能抵抗剪切力。 3MB-BAB-KDR與小鼠子宮血管內皮細胞的KDR體內靶向結合實驗 雌雄小鼠合籠后,分別就不同時間(DO,D2,D4)進行AMB-BAB-KDR靶向超聲造影。觀察小鼠子宮超聲靶向顯影綠色偽彩區(qū),DO期為0級,D2、D4期分別為Ⅰ級、Ⅱ級；病理實驗證實,小鼠子宮血管內皮細胞的KDR的表達在D0、D2、D4期是陰性、弱陽性、陽性,而應用MB-B進行造影,小鼠子宮超聲靶向顯影綠色偽彩區(qū)在三組中均為0級。 結論 1本研究采用生物素-親和素橋法成功構建了攜KDR單抗的靶向脂質超聲微泡MB-BAB-KDR。 2體外結合實驗證實,制備的MB-BAB-KDR可與KDR高表達的HUVECs特異性結合形成花環(huán)樣結構,并可與流動腔上的KDR Fc包被穩(wěn)定結合,結合數目隨著KDR Fc包被濃度及時間增加呈現增多趨勢,表明制備的MB-BAB-KDR保留了與KDR特異性結合的生物活性及抵抗一定血流剪切力的能力,為體內靶向分子檢測KDR奠定了實驗基礎。 3小鼠體內實驗證實,制備的MB-BAB-KDR可與小鼠子宮血管內皮細胞的KDR結合,并且超聲分子顯影級別與KDR的表達水平一致,初步實現了子宮血管內皮細胞KDR表達的靶向超聲分子檢測,使基于KDR的子宮內膜容受性無創(chuàng)性評價成為可能。 4本課題的實施使臨床上應用靶向超聲造影技術無創(chuàng)評價子宮內膜容受性成為可能。另外該課題的實施對于與子宮內膜容受性相關的其他細胞因子的靶向分子顯像有推廣作用,為進一步超聲介導載藥或載基因微泡對改善子宮內膜容受性的靶向治療及療效評價提供了技術支持。
【關鍵詞】：靶向超聲造影劑 KDR 子宮內膜容受性 平行板流動腔
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R714.8;R816.91
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-24
• 前言24-27
• 第一章 MB-BAB-KDR的制備及生物活性測定27-38
• 1 目的27
• 2 材料與方法27-30
• 3 結果30-32
• 4 討論32-37
• 5 結論37-38
• 第二章 MB-BAB-KDR的體外特異性結合及黏附穩(wěn)定性實驗38-52
• 1 目的38
• 2 材料與方法38-43
• 3 結果43-48
• 4 討論48-50
• 5 結論50-52
• 第三章 MB-BAB-KDR與小鼠子宮血管內皮細胞KDR的體內初步靶向結合實驗52-63
• 1 目的52
• 2 材料與方法52-56
• 3 結果56-59
• 4 討論59-62
• 5 結論62-63
• 全文總結63-64
• 不足之處及下一步要解決的問題64-65
• 參考文獻65-69
• 綜述69-76
• 參考文獻73-76
• 縮略語中英文對照表76-77
• 成果77-78
• 課題資助基金78-79
• 致謝79-80

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前7條

1 劉紅梅 ,邢福祺;人類ART中卵巢反應性與子宮內膜容受性超聲檢查研究[J];國外醫(yī)學(計劃生育分冊);2005年04期

2 ;Role of uterine natural killer cells in angiogenesis of human decidua of the first-trimester pregnancy[J];Science in China(Series C:Life Sciences);2008年02期

3 張群霞,王志剛,冉海濤,彭曉瓊,李曉東,彭明利,劉憲華,景香香,楊春江;超聲微泡促進腫瘤細胞報告基因轉染[J];臨床超聲醫(yī)學雜志;2005年02期

4 劉紅梅,邢福祺,陳士嶺;經陰道超聲對體外受精-胚胎移植中子宮內膜容受性的評價[J];中國超聲醫(yī)學雜志;2005年11期

5 劉紅梅;邢福祺;吳鳳林;王倩;;彩色多普勒超聲檢查子宮內膜在評價子宮內膜容受性中的價值[J];中國超聲醫(yī)學雜志;2007年07期

6 鄭道文;楊莉;賓建平;陳楚弟;陳少敏;王月剛;吳平生;;親和素橋連構建攜抗P-選擇素單抗靶向超聲微泡及體外熒光鑒定[J];中國醫(yī)學影像技術;2008年08期

7 紀麗景;燕翼;賓建平;;靶向超聲微泡靶點和配體的研究進展[J];中國醫(yī)學影像學雜志;2009年04期

  本文關鍵詞：可用以評價子宮內膜容受性的KDR單抗脂質聲學造影劑的制備及靶向結合實驗研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：486793