本文關(guān)鍵詞：沉默DNA-PKcs、ATM表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞生物學(xué)行為及放療敏感性的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤,發(fā)病率在女性所有惡性腫瘤中居第4位,但是在部分發(fā)展中國家,由于宮頸癌篩查不到位,其發(fā)病率可以居女性惡性腫瘤首位。據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界每年約有新發(fā)宮頸癌患者528,000例,因?qū)m頸癌導(dǎo)致的死亡約為266,000例,其中85%左右發(fā)生在發(fā)展中國家。宮頸癌是唯一明確病因的惡性腫瘤,持續(xù)的高危HPV感染是導(dǎo)致宮頸癌的原因,其中HPV16/18兩種病毒感染導(dǎo)致的宮頸癌占宮頸癌總數(shù)的80%左右。目前宮頸癌的治療主要包括手術(shù)、放療和化療。放療是宮頸癌的重要治療方法,特別對(duì)晚期宮頸癌患者。放射線能引起細(xì)胞DNA雙鏈斷裂(DSB),如果不能及時(shí)修復(fù)可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞中存在著對(duì)其存活至關(guān)重要的DNA損傷修復(fù)通路。腫瘤細(xì)胞對(duì)放療導(dǎo)致DNA損傷的修復(fù)能力是引起其對(duì)放療不敏感的重要原因。目前較為公認(rèn)的DSB修復(fù)機(jī)制主要有兩種:非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)和同源重組(HR)修復(fù),哺乳動(dòng)物細(xì)胞以NHEJ修復(fù)為主。DNA-PKcs和ATM分別在NHEJ和HR修復(fù)中起重要作用。臨床研究表明DNA-PKcs和ATM高表達(dá)的腫瘤患者疾病進(jìn)展較快,對(duì)放療不敏感,預(yù)后較差。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,通過RNA干擾抑制癌細(xì)胞DNA-PKcs或ATM的表達(dá)能增加其對(duì)放療的敏感性,并且對(duì)其部分惡性生物學(xué)行為有一定影響。但是還沒有研究同時(shí)抑制DNA-PKcs和ATM表達(dá)檢測(cè)其對(duì)宮頸癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為及放療敏感性的影響。研究目的探討抑制hela細(xì)胞dna-pkcs、atm的表達(dá)后,對(duì)其生物學(xué)行為及放療敏感性的影響。材料與方法1.構(gòu)建干擾質(zhì)粒:將針對(duì)dna-pkcs和atm的干擾rna分別及同時(shí)連入質(zhì)粒,合成含針對(duì)dna-pkcs、atm及dna-pkcs+atm的干擾質(zhì)粒。2.篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株及檢測(cè)沉默效果:將干擾質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞,嘌吟霉素篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。用westernblot和quantitativereal-timepcr檢測(cè)未轉(zhuǎn)染的hela細(xì)胞組(對(duì)照組),轉(zhuǎn)染干擾dna-pkcs表達(dá)hela細(xì)胞組(dna-pkcs組),轉(zhuǎn)染干擾atm表達(dá)hela細(xì)胞組(atm組)和轉(zhuǎn)染同時(shí)干擾dna-pkcs+atm表達(dá)hela細(xì)胞組(dna-pkcs+atm組)的dna-pkcs和atm蛋白和mrna表達(dá)水平,檢測(cè)沉默效果。3.cck8檢測(cè)對(duì)照組、單獨(dú)及同時(shí)沉默dna-pkcs、atm對(duì)hela細(xì)胞增殖活性的影響。4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組、單獨(dú)及同時(shí)沉默dna-pkcs、atm對(duì)hela細(xì)胞凋亡的影響。5.transwell小室侵襲模型檢測(cè)對(duì)照組、單獨(dú)及同時(shí)沉默dna-pkcs、atm對(duì)hela細(xì)胞侵襲能力的影響。6.克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組、單獨(dú)及同時(shí)沉默dna-pkcs、atm對(duì)hela細(xì)胞放療敏感性的影響。7.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析:數(shù)據(jù)采用spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn),符合正態(tài)性條件的結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,各組間比較采用方差分析或者非參數(shù)檢驗(yàn),組間兩兩比較用snk(student-newman-keuls,snk)法。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn),p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系及對(duì)沉默效果的檢測(cè):使用含嘌呤霉素的梯度培養(yǎng)基培養(yǎng)2周,確定嘌呤霉素對(duì)hela細(xì)胞的最佳篩選濃度為0.8ug/ml。然后用此濃度的篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的hela細(xì)胞,篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆。通過westernblot和quantitativereal-timepcr分別從蛋白水平和mrna水平檢測(cè)各組細(xì)胞中dna-pkcs和atm量的變化,結(jié)果顯示:dna-pkcs組和ATM+DNA-PKcs組的DNA-PKcs mRNA和蛋白水平均較其它組下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);ATM組和DNA-PKcs+ATM組ATM蛋白和mRNA均較其它組表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在24 h、48 h、72 h、96 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn),ATM+DNA-PKcs組增殖活性較對(duì)照組低,差異分別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在48 h、72 h、96 h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí),ATM+DNA-PKcs組增殖活性較ATM組低,DNA-PKcs組較對(duì)照組增殖活性低,差異分別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在72h、96 h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí),ATM+DNA-PKcs組較DNA-PKcs組增殖活性低,ATM組較對(duì)照組增殖活性低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);在96h時(shí),DNA-PKcs組較ATM組增殖活性低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。余差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:ATM+DNA-PKcs組較DNA-PKcs組、ATM組及對(duì)照組凋亡增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);DNA-PKcs組較ATM組和對(duì)照組凋亡增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),其余差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組穿過基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)少,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其中ATM+DNA-PKcs組的穿過基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)最少;ATM+DNA-PKcs組較ATM組和DNA-PKcs組穿過基質(zhì)膠細(xì)胞數(shù)少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其余則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.放療敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在2,4,6 Gy三個(gè)放射線劑量時(shí),實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組克隆形成率低,且ATM+DNA-PKcs組較DNA-PKcs組和ATM組克隆形成率低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在6Gy時(shí)DNA-PKcs組較ATM組克隆形成率低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);余差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.DNA-PKcs對(duì)HeLa細(xì)胞增殖、凋亡及放療敏感性的影響較ATM明顯。2.同時(shí)沉默宮頸癌HeLa細(xì)胞DNA-PKcs和ATM表達(dá)較單獨(dú)沉默DNA-PKcs或ATM,能更有效的增加HeLa細(xì)胞凋亡,抑制增殖和侵襲,特別是能明顯增加其放療敏感性。
【關(guān)鍵詞】：HeLa細(xì)胞 DNA-PKcs ATM 生物學(xué)行為 放療敏感性
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.33;R730.55
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 英文縮略詞12-14
• 引言14-18
• 材料與方法18-30
• 結(jié)果30-37
• 討論37-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-48
• 綜述 RNAI與宮頸癌放療敏感性相關(guān)基因的研究進(jìn)展48-60
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 個(gè)人簡歷60-61
• 致謝61

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本文編號(hào)：452714