目的： 腸上皮細胞是構(gòu)筑腸道粘膜屏障的主要部分，還具有分泌、吸收等多種功能，在維持機體生命活動中居重要的地位。在核爆炸、核事故等多種情況下可發(fā)生病死率極高的腸型放射病，目前尚無有效的救治方法。腸上皮細胞是輻射敏感細胞，受一定劑量照射后，可發(fā)生增殖抑制、結(jié)構(gòu)異常、壞死脫落，而且具有克隆形成能力的隱窩干細胞不能存活和重建小腸的隱窩、絨毛系統(tǒng)，導(dǎo)致腸道屏障的破壞以及修復(fù)困難，成為腸型放射病的根本原因。由于在體分離純化隱窩干細胞存在技術(shù)困難，目前學(xué)者大都使用具有隱窩未分化細胞特點的細胞株IEC-6作為體外研究模型。本研究利用IEC-6細胞進行大劑量輻射誘導(dǎo)的差異表達基因的篩選，旨在為腸上皮細胞的輻射損傷修復(fù)的分子機制研究提供新的靶點，為放射性胃腸綜合癥提供新的治療線索，同時將對細胞的增殖、分化、凋亡和轉(zhuǎn)化等基本的生命問題提供啟示和答案。 方法： 本研究以35Gyγ射線照射后24h的IEC-6細胞株為模型，分為兩個部分進行。第一部分：大劑量輻射誘導(dǎo)IEC-6細胞差異表達基因消減cDNA文庫的構(gòu)建。包括以下內(nèi)容：1）常規(guī)IEC-6細胞培養(yǎng)，傳代致一定數(shù)量，待細胞處于對數(shù)生長期時，隨機選取一半設(shè)為照...

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖2實驗方和驅(qū)動方雙鏈cDNARsaI酶切前后Lane1:正常組酶切前Lane2:正常組酶切后Lane3:照射組酶切前Lane4:照射組酶切后

平臺期從而確定最佳循環(huán)數(shù)為21cycles并合成了足量的雙鏈cDNA(見照片6)經(jīng)RsaI酶切3h后于1%的瓊脂糖/EB凝膠上電泳分析酶切效果結(jié)果表明酶切后片段大小分布在0.1-2kb之間(見圖2和照片7)明顯比未經(jīng)酶切的對照短熒光smear帶重心....

圖1RNA甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳Lane1:正常組IEC-6細胞總RNALane2:照射組IEC-6細胞總RNA

圖2實驗方和驅(qū)動方雙鏈cDNARsaI酶切Lane1:正常組酶切前Lane2:正常組酶切Lane3:照射組酶切前Lane4:照射組酶切LaneM:mark1RNA甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳ne1:正常組IEC-6細胞總RNAane2:照射組IE....

圖4正向消減雜交第一次PCR和第二次PCR產(chǎn)物

第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文圖2實驗方和驅(qū)動方雙鏈cDNARsaI酶切前后Lane1:正常組酶切前Lane2:正常組酶切后Lane3:照射組酶切前Lane4:照射組酶切后膠電泳RNARNA

圖6.克隆U20的正向Northernblot分析

討論然可以使差異表達序列得到有效的富集但是存在相當(dāng)行進一步篩選傳統(tǒng)的差異表達基因的篩選方法是將菌雜交但當(dāng)成分復(fù)雜的篩選探針和濾膜雜交時容易受而形成非特異結(jié)合使檢測稀有轉(zhuǎn)錄子克隆非常困難7年建立了一套高通量的差異基因篩選方法通過菌落的插入片段堿變性后交聯(lián)在尼龍....

本文編號：3928096