本文關(guān)鍵詞：血凝酶—脂質(zhì)體—微泡復(fù)合物的制備及其體外凝血的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景： 活動(dòng)性出血是腹部實(shí)質(zhì)臟器閉合性創(chuàng)傷急性致死的主要因素之一。目前常用的方法止血方法有外科手術(shù)、選擇性動(dòng)脈栓塞以及射頻凝固等方法,但是它們具有的愈后差、操作復(fù)雜以及容易損傷創(chuàng)傷部位周圍正常組織等缺陷。因此我們擬探索一種更為簡(jiǎn)便、有效以及無(wú)創(chuàng)的止血方式控制活動(dòng)性出血。我們擬通過(guò)一種載體運(yùn)載止血?jiǎng)┑竭_(dá)活動(dòng)性出血部位,通過(guò)低機(jī)械指數(shù)超聲發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性出血部位,而后通過(guò)聚焦超聲激發(fā)載體釋放止血?jiǎng)?從而達(dá)到止血目的。脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物集合了脂質(zhì)體以及微泡的優(yōu)勢(shì),既可以超聲顯影又可以運(yùn)載藥物被超聲激發(fā)釋藥,然而將其用于止血的研究尚不多見。本研究擬采用此載體,將血凝酶包封于脂質(zhì)體內(nèi)并通過(guò)親和素-生物素系統(tǒng)將其與微泡相連,制備載止血?jiǎng)┑闹|(zhì)體-微泡復(fù)合物,為實(shí)現(xiàn)腹部實(shí)質(zhì)臟器閉合性創(chuàng)傷活動(dòng)性出血的一體化診療新方法奠定基礎(chǔ)。 第一章脂質(zhì)體包封血凝酶的實(shí)驗(yàn)研究 研究目的： 研究脂質(zhì)體包封血凝酶的可行性。 材料和方法： 1兩種逆相蒸發(fā)法的選擇 以DPPC (1,2-Dipalmitoyl-Sn-Glycero-3-Phosphocholine,二棕櫚酰磷脂酰膽堿)、CH (Cholesterol,膽固醇)、DSPE-PEG2000Biotin (1,2-Distearoyl-Sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Biotinyl (Polyethylene Glycol)-2000],生物素酞化聚乙二醇2000修飾二硬脂酸磷酯酰乙醇胺)為原料,通過(guò)兩種逆相蒸發(fā)法包封血凝酶,檢測(cè)所得脂質(zhì)體的粒徑,并對(duì)脂質(zhì)體懸液的外觀進(jìn)行觀察,初步評(píng)估脂質(zhì)體濃度。4℃儲(chǔ)存12h、24h、36h后觀察脂質(zhì)體懸液外觀變化,從而確定本實(shí)驗(yàn)所用血凝酶的包封方法。 2脂質(zhì)體包封血凝酶 將血凝酶凍干粉末溶解于去離子水中,于4℃進(jìn)行透析處理,透析4.5h。將DPPC、CH、DSPE-PEG2000Biotin粉末以摩爾比60：40：5完全溶解于三氯甲烷中,加入15%三氯甲烷體積的無(wú)水乙醚。加入有機(jī)溶劑1/3體積的血凝酶溶液。對(duì)混合液進(jìn)行聲振處理4min。將混合液真空條件下干燥處理1h。取干燥后混合液,14000g離心處理30min。取下層乳白色凝膠物以11mmol/1旨質(zhì)濃度溶解于去離子水,充分混合均勻。 3理化性質(zhì)檢測(cè) 通過(guò)納米粒度及電位分析儀檢測(cè)血凝酶-脂質(zhì)體的粒徑以及表面電位；將血凝酶-脂質(zhì)體懸液分別于室溫(25℃)及4℃靜置12h、24h、36h、48h,觀察脂質(zhì)體懸液有無(wú)渾濁、沉淀及分層；梯度稀釋血凝酶溶液,按照BCA(Bicinchoninic Acid,二喹啉甲酸)蛋白濃度測(cè)定的方法,于562nm檢測(cè)吸光度,繪制血凝酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)公式計(jì)算包封率： W總代表脂質(zhì)體懸液加入終濃度為1%的Triton X-100水溶液處理后至脂質(zhì)體完全破裂溶液中的藥物總量。W游離代表未經(jīng)過(guò)處理前懸液中未包封的藥物含量。 結(jié)果： 第二種逆相蒸發(fā)法包封1單位/ml血凝酶的脂質(zhì)體的濃度第一種逆相蒸發(fā)法包封2單位/ml血凝酶的脂質(zhì)體的濃度第一種逆相蒸發(fā)法包封1單位/ml血凝酶的脂質(zhì)體的濃度。第一種逆相蒸發(fā)法包封2單位/m1血凝酶的脂質(zhì)體的粒徑第一種逆相蒸發(fā)法包封1單位/m1血凝酶的脂質(zhì)體的粒徑第二種逆相蒸發(fā)法包封1單位/ml血凝酶的脂質(zhì)體的粒徑。本研究選擇第二種逆相蒸發(fā)法制備血凝酶-脂質(zhì)體,通過(guò)此方法獲得的血凝酶-脂質(zhì)體懸液呈均一半透明狀態(tài),平均粒徑約(431.95±19.04)nm,表面電位為(-22.13±0.35)mv,并于室溫(25℃)及4℃靜置48h內(nèi)無(wú)渾濁、沉淀及分層。 結(jié)論： 血凝酶可以通過(guò)逆相蒸發(fā)法被脂質(zhì)體包封,粒徑為納米級(jí),表面帶負(fù)電,具有良好的穩(wěn)定性,包封率為35.08%,為與微泡相連奠定了基礎(chǔ)。 第二章親和素-生物素法連接血凝酶-脂質(zhì)體與微泡的實(shí)驗(yàn)研究 研究目的： 研究親和素-生物素系統(tǒng)對(duì)連接血凝酶-脂質(zhì)體與微泡的價(jià)值。 材料和方法： 1生物素化微泡的制備 將DSPC (1,2-Distearoyl-Sn-Glycero-3-Phosphatidylcholine,二硬脂酰磷酯酰膽堿)、DSPE-PEG2000(1,2-Distearoyl-Sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene Glycol)-2000],聚乙二醇2000-二硬脂酸磷酯酰乙醇胺)、DSPE-PEG2000Biotin粉末以摩爾比90：5：5完全溶解于三氯甲烷中。將脂質(zhì)溶液于65℃進(jìn)行水浴處理,同時(shí)氮?dú)饬飨麓蹈商幚?形成均勻脂質(zhì)薄膜。對(duì)脂質(zhì)薄膜干燥處理至完全干燥。將Tris緩沖液加入脂質(zhì)薄膜內(nèi)。將水合后的脂質(zhì)溶液于65℃恒溫進(jìn)行聲振處理。反復(fù)多次將C3F8(Perfluoropropane,全氟丙烷)通入溶液中直至呈飽和狀態(tài)。通過(guò)機(jī)械振蕩換氣后的脂質(zhì)溶液,形成生物素化微泡。 2生物素化微泡的理化性質(zhì)檢測(cè) 通過(guò)顆粒計(jì)數(shù)分析儀檢測(cè)生物素化微泡的粒徑及濃度；通過(guò)納米粒度及電位分析儀檢測(cè)生物素化微泡的表面電位；通過(guò)倒置系統(tǒng)顯微鏡明視野下觀察生物素化微泡的形態(tài)與分布；將生物素化微泡放置于4℃儲(chǔ)存,分別于制備后即刻、24h、48h、72h、1周后,通過(guò)顆粒計(jì)數(shù)分析儀檢測(cè)生物素化微泡的粒徑及濃度變化。 3血凝酶-脂質(zhì)體與生物素化微泡的連接及驗(yàn)證 3.1磁性微泡的制備及磁性吸附觀察 將純化后的生物素化微泡與親和素孵育連接后,再與等體積的生物素化的右旋糖苷氧化鐵納米粒孵育30min,得到磁性微泡。 將磁性微泡注入透明軟管內(nèi),將透明軟管靜置5min,用超聲實(shí)時(shí)分子影像系統(tǒng)實(shí)時(shí)觀察磁性微泡的運(yùn)動(dòng)變化及顯影情況。在與磁性微泡運(yùn)動(dòng)方向相反的方向放置永磁鐵。待永磁鐵放置5min后,觀察磁性微泡的運(yùn)動(dòng)變化及顯影情況。采用PBS (Phosphate Buffered Saline,磷酸鹽緩沖液)作為空白對(duì)照。 3.2FITC標(biāo)記血凝酶的脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物的制備及連接觀察 將2單位/1的血凝酶溶液與1mmol/1的FITC (Fluorescein Isothiocyanate,異硫氰酸熒光素)水溶液于4℃避光孵育10h。而后透析處理。將DPPC、CH、DSPE-PEG2000Biotin粉末以摩爾比60：40：5溶解于三氯甲烷中,加入15%三氯甲烷體積的無(wú)水乙醚。加入有機(jī)溶劑1/3體積的FITC標(biāo)記的血凝酶溶液。對(duì)混合液進(jìn)行聲振處理4min。將混合液真空條件下干燥處理1h。取干燥后混合液14000g離心處理30min。取下層黃綠色凝膠物以11mmol/1脂質(zhì)濃度溶解于去離子水,充分混合均勻。將1m1生物素化微泡用去離子水以300g離心3min,洗滌4次。而后將生物素化微泡與過(guò)量親和素溶液孵育15min。用去離子水以300g離心3min,洗滌4次。將上述已連接親和素的生物素化微泡與500u1FITC標(biāo)記血凝酶的脂質(zhì)體懸液孵育15min。用去離子水將上述FITC標(biāo)記血凝酶的脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物懸液以300g離心3min,洗滌數(shù)次,直至洗滌液澄清,呈無(wú)色。 將FITC標(biāo)記血凝酶的脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物經(jīng)過(guò)去離子水稀釋后,于倒置系統(tǒng)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)及熒光性觀察。 4血凝酶-脂質(zhì)體與微泡添加比例的實(shí)驗(yàn) 純化生物素化微泡,將其與親和素連接。將連接親和素后的等量生物素化微泡分別與250μl和500μl血凝酶-脂質(zhì)體懸液孵育,得到血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物,并純化血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物。對(duì)其粒徑及濃度進(jìn)行檢測(cè),從而分析生物素化微泡與血凝酶-脂質(zhì)體比例對(duì)血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物的粒徑及濃度的影響。 5血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物的理化性質(zhì)檢測(cè) 將血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物置于顆粒計(jì)數(shù)分析儀內(nèi)進(jìn)行粒徑及濃度檢測(cè)。將血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物經(jīng)過(guò)去離子水稀釋后加入納米粒度及電位分析儀內(nèi)進(jìn)行表面電位檢測(cè)。將純化后的血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物經(jīng)過(guò)去離子水稀釋后于倒置系統(tǒng)顯微鏡明視野下觀察其形態(tài)與分布。取血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物共400μl,每100μl吸入1ml注射器內(nèi),將4只注射器分別以0、125μl/min,500μl/min,1000μl/min的速度進(jìn)行推注,并收集推注后的懸液,取懸液下層清液,將其與BCA蛋白濃度測(cè)定試劑反應(yīng)后,于562nm檢測(cè)吸光度,從而分析推注速度對(duì)血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物的穩(wěn)定性的影響。將血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物(濃度數(shù)量級(jí)為109個(gè)/ml)及用去離子水分別稀釋10倍(濃度數(shù)量級(jí)為108個(gè)/ml)、100倍(濃度數(shù)量級(jí)為107個(gè)/ml)、103倍(濃度數(shù)量級(jí)為106個(gè)/ml)、104倍(濃度數(shù)量級(jí)為105個(gè)/ml)、105倍(濃度數(shù)量級(jí)為104個(gè)/ml)、106倍(濃度數(shù)量級(jí)為103個(gè)/ml)后裝入7組透明離心管內(nèi),另外將1組透明離心管內(nèi)裝入等量去離子水作為空白對(duì)照組。對(duì)8組透明離心管進(jìn)行超聲實(shí)時(shí)顯影,實(shí)時(shí)記錄和觀察血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物隨濃度變化的顯影特點(diǎn),并通過(guò)各組感興趣區(qū)的灰階值測(cè)量對(duì)血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物的聲學(xué)性質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。 結(jié)果： 生物素化微泡的平均粒徑約為(1.11±0.21)μm,濃度約為(2.79±1.64)×109個(gè)/m1,表面電位為(-24.10±1.01)mv,顯微鏡下呈圓形,中心透亮,分布較均勻,無(wú)粘附聚集。4℃下,其粒徑隨著時(shí)間變化而逐漸增大,濃度隨著時(shí)間變化而逐漸減低。 磁性微泡具有超聲增強(qiáng)顯影效果并且因?yàn)榫哂许槾判远梢员挥来盆F吸附移動(dòng)。FITC標(biāo)記血凝酶的脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物于熒光激發(fā)下可見呈圓形,中心透亮,外周被黃綠色熒光所包繞,這些結(jié)果證實(shí)親和素-生物素系統(tǒng)可以將血凝酶-脂質(zhì)體與生物素化微泡進(jìn)行有效的連接。 等量生物素微泡連接250u1和500u1血凝酶-脂質(zhì)體對(duì)血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物的粒徑的影響無(wú)顯著性意義。本實(shí)驗(yàn)最終選用500μl血凝酶-脂質(zhì)體懸液加入量制備血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物。所得血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物的平均粒徑約為(4.01±0.40)u m,濃度約(1.80±0.48)×109個(gè)/ml,表面電位為(-27.87±0.68)mv。顯微鏡下呈圓形,中心透亮,分布較均勻,無(wú)粘附聚集。125μl/min以內(nèi)的推注速度引起血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物的滲漏可以忽略不計(jì),而500μl/min、1000μl/min的推注速度均可以引起血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物的明顯滲漏。將血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物稀釋100倍(濃度數(shù)量級(jí)為107個(gè)/ml)、103倍(濃度數(shù)量級(jí)為106個(gè)/ml)、104倍(濃度數(shù)量級(jí)為105個(gè)/ml)時(shí)為適宜顯影濃度,增強(qiáng)回聲均勻,既不會(huì)因?yàn)槁曈爱a(chǎn)生而影響圖像顯影,也不會(huì)因?yàn)闈舛冗^(guò)度導(dǎo)致灰階值變化明顯。 結(jié)論： 親和素-生物素系統(tǒng)是一種有效的連接方式,它可以將包封血凝酶的脂質(zhì)體牢固地連接于微泡表面,形成的血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物,理化性質(zhì)較穩(wěn)定。 第三章超聲激發(fā)血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物體外凝血實(shí)驗(yàn)研究目的： 研究超聲激發(fā)血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物釋藥體外凝血的效果。材料和方法： 將1m1生物素化微泡以300g離心3min,洗滌4次。將純化后的生物素化微泡與過(guò)量的親和素溶液孵育15min。以300g離心3min,洗滌4次,離心洗滌過(guò)量游離親和素。將連接親和素后的生物素化微泡與500μl血凝酶-脂質(zhì)體懸液孵育15min得到血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物。以300g離心3min,洗滌4次純化。 將血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物用去離子水稀釋10倍后取100u1,通過(guò)2.25MHz聚焦超聲用4.17w/cm2和8.34w/cm2分別對(duì)血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物激發(fā)30s,加入450μl兔血漿。而后加入40mg/ml CaCl2(Calcium Chloride,氯化鈣)啟動(dòng)凝血過(guò)程,分別于25℃和37℃用1m1注射器的針頭在同樣的方向和深度以挑取纖維蛋白為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算凝血時(shí)間。以去離子水及血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物不通過(guò)超聲處理組作為對(duì)照組。 結(jié)果： 凝血時(shí)間：去離子水組血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物組血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物通過(guò)4.17w/cm2超聲激發(fā)組血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物通過(guò)8.34w/cm2超聲激發(fā)組。25℃時(shí)的凝血時(shí)間37℃時(shí)的凝血時(shí)間。血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物能夠縮短凝血時(shí)間,對(duì)血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物進(jìn)行超聲激發(fā)處理后,超聲可以激發(fā)微泡促進(jìn)相連的脂質(zhì)體釋放被包封的血凝酶。此連接方式并沒有影響血凝酶的凝血功能,并且超聲處理時(shí)增大聲強(qiáng)(8.34w/cm2),能夠增加藥物釋放,而表現(xiàn)為進(jìn)一步縮短凝血時(shí)間。此外,37℃的體外凝血實(shí)驗(yàn)較25℃時(shí)相比具有更明顯的實(shí)驗(yàn)效果。 結(jié)論： 血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物在聚焦超聲激發(fā)下可以明顯縮短凝血時(shí)間,37℃的體外凝血實(shí)驗(yàn)較25℃時(shí)相比具有更明顯的實(shí)驗(yàn)效果,該結(jié)果為后期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：脂質(zhì)體 血凝酶 逆相蒸發(fā)法 脂質(zhì)體 微泡 血凝酶 親和素 生物素 超聲 脂質(zhì)體 微泡 血凝酶 凝血
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R656.1;R816.5
【目錄】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-25
• 前言25-30
• 第一章 脂質(zhì)體包封血凝酶的實(shí)驗(yàn)研究30-43
• 1 材料與方法30-33
• 2 結(jié)果33-39
• 3 討論39-42
• 4 結(jié)論42-43
• 第二章 親和素-生物素法連接血凝酶-脂質(zhì)體與微泡的實(shí)驗(yàn)研究43-63
• 1 材料與方法43-48
• 2 結(jié)果48-59
• 3 討論59-62
• 4 結(jié)論62-63
• 第三章 超聲激發(fā)血凝酶-脂質(zhì)體-微泡復(fù)合物體外凝血實(shí)驗(yàn)63-68
• 1 材料和方法63-65
• 2 結(jié)果65-66
• 3 討論66-67
• 4 結(jié)論67-68
• 參考文獻(xiàn)68-75
• 縮略詞表75-76
• 攻讀學(xué)位期間所取得成果76-79
• 致謝79-80

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 陳向齊;張朝春;劉向農(nóng);;靜脈推注蛇毒血凝酶(巴曲亭)引起過(guò)敏性休克1例[J];福州總醫(yī)院學(xué)報(bào);2009年03期

2 郭燕麗;范校周;;超聲分子影像學(xué):現(xiàn)狀與將來(lái)[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2014年01期

3 陳志良,陳樹元,金偉軍,單友亮;超聲造影劑的研究進(jìn)展[J];解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào);1999年02期

4 侯欣欣;張皓;張東生;;磁性納米顆粒作為基因載體的研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2013年02期

5 王春玲;;超聲檢查在閉合性腹部損傷中的應(yīng)用價(jià)值[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志;2009年28期

6 孫加司;蔡景鈺;陳思嬌;邵義;宋今丹;;納米磁珠技術(shù)在單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀[J];醫(yī)學(xué)綜述;2011年07期

7 王月香;唐杰;梅興國(guó);安力春;林倩;李俊來(lái);徐建宏;;灰階超聲造影對(duì)肝外傷活動(dòng)性出血的診斷研究[J];中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)雜志;2005年12期

8 李文秀;唐杰;呂發(fā)勤;張惠琴;李俊來(lái);安力春;楊立;;超聲造影評(píng)價(jià)不同級(jí)別肝脾外傷與CT對(duì)照的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)超聲醫(yī)學(xué)雜志;2007年12期

9 段康穎;王從容;李琦;;新型的藥物載體——脂質(zhì)體[J];中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志;2010年10期

10 冉海濤;;靶向超聲造影顯像研究現(xiàn)狀與進(jìn)展[J];中華醫(yī)學(xué)超聲雜志(電子版);2011年05期

  本文關(guān)鍵詞：血凝酶—脂質(zhì)體—微泡復(fù)合物的制備及其體外凝血的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：382003