發(fā)布時間：2017-05-03 05:02

  本文關鍵詞：dTMP活性肽的篩選及其對放射損傷小鼠血小板減少癥的救治作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：血小板由骨髓巨核細胞產(chǎn)生，不僅具有凝血、止血功能，而且還參與機體抗感染、血管及組織修復等重要病理生理過程。骨髓為輻射敏感器官，當人員暴露于電離輻射后，骨髓造血干細胞的增殖與分化活性受到抑制，從而引起體內巨核細胞數(shù)量嚴重減少，導致外周血血小板水平低下，易發(fā)生惡性出血、感染甚至危及生命。此外，臨床上原發(fā)性或繼發(fā)性血小板減少癥也頗為常見，如特發(fā)性血小板減少性紫癜、再生障礙性貧血以及惡性腫瘤化/放療等也可導致血小板減少癥的發(fā)生。促進巨核細胞增殖分化，加速血小板的生成是提高外周血血小板水平、有效救治血小板減少癥的關鍵所在。然而，目前臨床上針對血小板減少癥的特效藥物和救治手段較為缺乏，并且還存在著毒副反應突出、治療費用高昂等諸多缺陷。所以，探尋高效促血小板生成藥物并對其作用機制進行深入研究具有重要意義。 促血小板生成素(Thrombopoietin,TPO),又稱巨核細胞生長及發(fā)育因子(megakaryocyte growth and development factor, MGDF)，共由332個氨基酸組成，能夠與巨核細胞表面相應的受體c-Mpl結合，從而刺激巨核系祖細胞/巨核細胞的增殖與成熟分化，并最終促進血小板的產(chǎn)生與釋放。TPO是目前已知的巨核細胞及血小板系統(tǒng)最主要、作用最強的細胞調節(jié)因子。但是，通過基因工程制備并經(jīng)聚乙二醇修飾的第一代巨核系生長因子類基因工程藥物(rhTPO和rhMGDF)因在臨床試驗過程中誘發(fā)機體產(chǎn)生針對TPO的中和性抗體，造成自身內源性TPO活性受抑，從而導致血小板數(shù)量進一步減少。因此，美國食品與藥品管理局(FDA)至今未批準rhTPO類藥物進入臨床。目前國外研究機構已基本停止了對重組人TPO的藥用研發(fā)，轉而探尋TPO類似物或其它模擬物。 Cwirla等學者于1997年運用噬菌體表面展示技術篩選到了一種與天然TPO生物學特性相似而又與TPO無序列同源性的短肽(僅由14個氨基酸構成)，命名為促血小板生成素模擬肽(Thrombopoietin mimetic peptide, TMP)。研究證實，TMP與巨核細胞表面TPO受體(c-Mpl)具有較高的親和能力，，可促進依賴TPO細胞株的增殖和分化，而且由于與天然TPO無相同氨基酸序列，所以不會誘導機體產(chǎn)生TPO中和性抗體。但是，由于其促血小板生成活性相對較弱，且在機體內半衰期較短，導致其推廣應用受到極大限制。 研究發(fā)現(xiàn)，TPO之所以具有突出的促巨核細胞增殖、分化和升血小板活性，是因為它能夠同時結合兩個配對的c-Mpl分子，而也只有當c-Mpl分子形成二聚體后才能激活胞內有關增殖、分化的信號通路。由于一個TMP單體肽只能結合一個c-Mpl分子，所以盡管其與c-Mpl分子具有較高的親和力，但是其促巨核細胞增殖、分化的活性并不突出。如果將兩條TMP單鏈連接形成TMP二聯(lián)體(dTMP)，一個dTMP多肽則可以同時結合兩個配對的c-Mpl分子，從而顯著提高其促血小板生成活性。 有研究報道，促紅細胞生成素(Erythropoietin，EPO)的模擬肽EMP1與同源肽EMP33均可與受體EPOR結合，但是EMP33并不能激活EPOR下游的JAK-STAT信號通路，原因在于EMP1和EPOR的復合體與EMP33和EPOR的復合體的旋轉角度不同(相差約15度)。有研究提示兩個EMP1之間的連接肽可以調節(jié)兩個EMP1的角度，所以選擇合適的連接肽對于提高EMP1二聚體的活性至關重要。同理，兩個TMP之間連接肽的選擇也會對dTMP與c-Mpl的結合及其促血小板生成活性產(chǎn)生顯著影響。 因此，為了尋找具有突出升血小板活性的dTMP線性多肽，在本研究中我們首先設計并合成了一系列由不同連接肽將兩個TMP頭尾串聯(lián)起來的dTMP多肽，從長度及氨基酸組成兩個層面對連接肽進行篩選。然后，從激活細胞內相關信號通路的角度探討dTMP優(yōu)選肽促巨核細胞增殖分化的作用機制，同時，結合分子動力學模擬及分子對接軟件對dTMP的三維結構及其與受體c-Mpl的結合方式進行分析。最后，復制急性放射損傷小鼠血小板減少癥實驗動物模型，觀察dTMP優(yōu)選肽對放射損傷所致小鼠血小板減少的救治作用。所獲得的主要研究結果與結論如下： 1.連接肽長度對dTMP的促巨核細胞增殖活性具有顯著影響，其中由8個G(甘氨酸)作為連接肽的dTMP活性較為突出。 2.通過對連接肽的氨基酸組成進行調整，發(fā)現(xiàn)在連接肽結構中加入脯氨酸(Proline,P)可顯著提升dTMP的促巨核細胞增殖活性。 3.通過兩輪篩選最終獲得與等摩爾TPO具有相似活性的dTMP優(yōu)選肽(命名為No.341多肽)。 4.小鼠骨髓原代巨核細胞檢測結果顯示，經(jīng)No.341多肽刺激培養(yǎng)14天，小鼠Sca+-I細胞表面CD41/CD61(巨核細胞成熟標志物)的表達水平較IL-3對照組顯著增高(83.26±6.26%vs15.70±2.31%, P＜0.01)，進一步證實該TMP二聯(lián)肽具有顯著促巨核細胞成熟、分化的作用。 5. Western blot結果顯示，dTMP(No.341多肽)作用10min即可顯著上調M07e細胞內JAK-STAT5及ERK1/2的磷酸化水平。另一方面，給予JAK-STAT和ERK信號通路阻斷劑則可以顯著抑制No.341多肽的促巨核細胞增殖作用，提示dTMP生物活性的發(fā)揮與其能夠快速激活STAT5和ERK1/2信號通路有關。 6.分子動力學模擬及分子對接分析結果表明，連接肽的長度和氨基酸組成可以顯著影響dTMP的空間構象，包括兩條TMP單鏈之間的角度、跨度以及活性位點的暴露等，并能決定dTMP與c-Mpl的分子對接方式，在一定程度上揭示了連接肽影響dTMP活性的內在機制。 7.與生理鹽水對照相比，dTMP(No.341多肽)能夠顯著提高急性放射損傷(5GyCo60γ射線照射)小鼠的外周血血小板最低值水平，并能促進血小板水平恢復，證實dTMP對血小板減少癥具有顯著救治作用。
【關鍵詞】：TMP 二聯(lián)體多肽 血小板生成 血小板減少 連接肽 放射損傷
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R818.74
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• Abstract7-10
• 摘要10-13
• 第一章 前言13-16
• 1.1 選題緣由13
• 1.2 研究背景13-14
• 1.3 研究意義14
• 1.4 研究內容14-15
• 1.5 研究方法15-16
• 第二章 促巨核細胞增殖及升血小板活性 dTMP 線性多肽的篩選16-29
• 2.1 材料與方法16-20
• 2.2 結果20-26
• 2.3 討論26-27
• 2.4 小結27-29
• 第三章 dTMP 促進巨核細胞增殖分化的機制及構效關系研究29-53
• 3.1 材料與方法29-38
• 3.2 結果38-47
• 3.3 討論47-51
• 3.4 小結51-53
• 第四章 dTMP 對輻射誘導小鼠血小板減少癥的救治作用研究53-62
• 4.1 材料與方法53-56
• 4.2 結果56-60
• 4.3 討論60-61
• 4.4 小結61-62
• 全文總結62-64
• 參考文獻64-69
• 文獻綜述 促分裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)對巨核細胞增殖分化及血小板生成調控的研究進展69-79
• 參考文獻76-79
• 攻讀學位期間的研究成果79-80
• 致謝80

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