目的利用MassARRAY和焦磷酸測序兩種方法檢測的DNA甲基化數(shù)據(jù)在年齡推斷中的差異,探討兩種檢測方法的年齡推斷計(jì)算方法。方法應(yīng)用MassARRAY和焦磷酸測序,分別對65份和62份外周血樣本的9個CpG位點(diǎn)的甲基化水平進(jìn)行測定,運(yùn)用多元線性回歸模型預(yù)測年齡,對比預(yù)測年齡與實(shí)際年齡之間的差異;對比Z-score轉(zhuǎn)化前后兩種方法之間的年齡預(yù)測差異。結(jié)果 MassARRAY法,65樣本集數(shù)據(jù)Z-score轉(zhuǎn)化前,平均絕對誤差（MAD）=2.49歲,Z-score轉(zhuǎn)化后,MAD=2.44歲;62樣本集數(shù)據(jù)Z-score轉(zhuǎn)化前,MAD=3.36歲,Z-score轉(zhuǎn)化后,MAD=3.42歲。焦磷酸測序法,65樣本集數(shù)據(jù)Z-score轉(zhuǎn)化前,MAD=4.20歲,Z-score轉(zhuǎn)化后,MAD=2.76歲;62樣本集數(shù)據(jù)Z-score轉(zhuǎn)化前,MAD=3.92歲,Z-score轉(zhuǎn)化后,MAD=3.63歲。結(jié)論 Zscore轉(zhuǎn)化方法能夠有效的消除MassARRAY和焦磷酸測序數(shù)據(jù)之間的系統(tǒng)性批次效應(yīng);MassARRAY數(shù)據(jù)可以直接使用進(jìn)行樣本的年齡預(yù)測;使用焦磷酸測序數(shù)據(jù)進(jìn)行年齡預(yù)測結(jié)果誤差較大,但可以... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2020,40(12)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

MassARRAY和焦磷酸測序的CpG位點(diǎn)的甲基化水平比較

本項(xiàng)研究進(jìn)一步證明不同的甲基化檢測方法存在系統(tǒng)性差異，而且這種差異可以通過Z-score轉(zhuǎn)換算法得到有效降低。通過Z-score轉(zhuǎn)換技術(shù)可以有效的將利用焦磷酸測序DNA甲基化數(shù)據(jù)進(jìn)行年齡預(yù)測的誤差降低到同MassARRAY相似的水平。但是，由于目前的年齡預(yù)測模型是基于MassARRAY數(shù)據(jù)構(gòu)建的，因此對于MassARRAY檢測的數(shù)據(jù)，可以直接通過我們已發(fā)表的年齡預(yù)測網(wǎng)站進(jìn)行年齡推斷（http://liufan.big.ac.cn/AgePrediction/）[23-24]，進(jìn)而應(yīng)用于刑事科學(xué)技術(shù)年齡推斷；焦磷酸測序數(shù)據(jù)則必須首先將檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行Z-score轉(zhuǎn)化才能得到相對準(zhǔn)確的預(yù)測結(jié)果，而單個樣本無法進(jìn)行Z-score轉(zhuǎn)化以及樣本太少會造成較大的Z-score轉(zhuǎn)化誤差，因此在利用Z-score轉(zhuǎn)化模型時需要時間積累焦磷酸平臺樣本數(shù)據(jù)，但這對于實(shí)際的案件應(yīng)用所面臨的迫切性是矛盾的。針對這個問題，我們建議目前統(tǒng)一使用MassARRAY進(jìn)行DNA甲基化水平檢測。另外，隨著時間的積累，當(dāng)積累了足夠多的焦磷酸測序數(shù)據(jù)后，重新訓(xùn)練一個針對焦磷酸測序檢測方法的年齡預(yù)測模型不失為一個更好的解決方案，并對比兩種方法的年齡預(yù)測成效，從而使甲基化推斷年齡在刑事技術(shù)方面發(fā)揮更大的作用。

甲基化的定量檢測分為3步：亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化、PCR擴(kuò)增、甲基化測定。MassARRAY和焦磷酸測序在技術(shù)原理方面存在差異，其差異重點(diǎn)是第三步甲基化測定。首先檢測前對基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化[26],DNA中未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║），而甲基化的胞嘧啶（C）保持不變，因此將甲基化的差異變?yōu)樾蛄械牟町�。亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)換后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將序列差異性成比例的放大后用于下一步的甲基化定量檢測。在甲基化測定中，MassARRAY和焦磷酸測序技術(shù)均需要4～5個小時完成定量檢測，而且都被用于法庭科學(xué)年齡推斷研究[16,27]，但是兩種方法檢測原理不同。MassARRAY結(jié)合了堿基特異性酶切反應(yīng)和MALDI-TOF檢測原理，可實(shí)現(xiàn)多個CpG的分析檢測，堿基特異性酶切實(shí)驗(yàn)由亞硫酸氫鹽處理待測DNA開始，經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理，由此在DNA模板中產(chǎn)生甲基化特異的序列變化；利用5"末端帶有T7-啟動子的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)SAP處理后用于堿基特異性的酶切反應(yīng)；酶切后DNA片段的大小和分子量取決于亞硫酸氫鹽處理后的堿基變化，飛行質(zhì)譜能測出每個片段的分子量，配套軟件MassARRAY EpiTYPER則能自動報(bào)告每個相應(yīng)片段的甲基化程度[27-28]。焦磷酸測序是一種新的DNA序列分析技術(shù)，是在同一反應(yīng)體系中由4中酶催化的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。特異性引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將每一個d NTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，熒光信號的強(qiáng)度與結(jié)合的核苷酸數(shù)目成比例，然后通過熒光檢測裝置檢測熒光的釋放和強(qiáng)度，并通過軟件將光信號轉(zhuǎn)換為峰圖。反應(yīng)底物為5-磷酰硫酸和熒光素，反應(yīng)體系包括待測序DNA單鏈和測序引物。每一輪測序反應(yīng)中，加入1種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶可將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸集團(tuán)；硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驅(qū)動熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化熒光素轉(zhuǎn)化，發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號，并由Pyrogram轉(zhuǎn)化為一個峰值，其高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比；根據(jù)加入dNTP類型和熒光信號強(qiáng)度就可實(shí)時記錄模板DNA的核苷酸序列[29-30]。在本研究中，選取了兩個批次且相互獨(dú)立的樣本，分別使用MassARRAY和焦磷酸測序?qū)?個甲基化位點(diǎn)進(jìn)行檢測，并進(jìn)行了個體年齡推斷分析。結(jié)果顯示，進(jìn)行Z-score轉(zhuǎn)換前后，MassARRAY測得的MAD值差異不明顯；焦磷酸測序數(shù)據(jù)由MAD=4.20年降低為MAD=2.76年，可以更加準(zhǔn)確的預(yù)測年齡，因此，Z-score轉(zhuǎn)換能夠有效降低MassARRAY和焦磷酸測序數(shù)據(jù)之間的系統(tǒng)性批次效應(yīng)。本項(xiàng)研究進(jìn)一步證明不同的甲基化檢測方法存在系統(tǒng)性差異，而且這種差異可以通過Z-score轉(zhuǎn)換算法得到有效降低。通過Z-score轉(zhuǎn)換技術(shù)可以有效的將利用焦磷酸測序DNA甲基化數(shù)據(jù)進(jìn)行年齡預(yù)測的誤差降低到同MassARRAY相似的水平。但是，由于目前的年齡預(yù)測模型是基于MassARRAY數(shù)據(jù)構(gòu)建的，因此對于MassARRAY檢測的數(shù)據(jù)，可以直接通過我們已發(fā)表的年齡預(yù)測網(wǎng)站進(jìn)行年齡推斷（http://liufan.big.ac.cn/AgePrediction/）[23-24]，進(jìn)而應(yīng)用于刑事科學(xué)技術(shù)年齡推斷；焦磷酸測序數(shù)據(jù)則必須首先將檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行Z-score轉(zhuǎn)化才能得到相對準(zhǔn)確的預(yù)測結(jié)果，而單個樣本無法進(jìn)行Z-score轉(zhuǎn)化以及樣本太少會造成較大的Z-score轉(zhuǎn)化誤差，因此在利用Z-score轉(zhuǎn)化模型時需要時間積累焦磷酸平臺樣本數(shù)據(jù)，但這對于實(shí)際的案件應(yīng)用所面臨的迫切性是矛盾的。針對這個問題，我們建議目前統(tǒng)一使用MassARRAY進(jìn)行DNA甲基化水平檢測。另外，隨著時間的積累，當(dāng)積累了足夠多的焦磷酸測序數(shù)據(jù)后，重新訓(xùn)練一個針對焦磷酸測序檢測方法的年齡預(yù)測模型不失為一個更好的解決方案，并對比兩種方法的年齡預(yù)測成效，從而使甲基化推斷年齡在刑事技術(shù)方面發(fā)揮更大的作用。


本文編號：3397952