目的探討蛻皮甾酮（Ecdysterone,EDS）對損傷軟骨細胞增殖與凋亡的影響及其作用機制。方法1.手術(shù)分離SD大鼠膝關(guān)節(jié)股骨下端關(guān)節(jié)面軟骨組織。2.采用0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型膠原蛋白酶共同消化法獲取原代細胞。3.采用形態(tài)學(xué)觀察、甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫熒光染色的方法鑒定細胞。4.采用細胞劃傷的方法構(gòu)建損傷軟骨細胞模型,模擬軟骨損傷的生物學(xué)變化。5.篩選EDS作用于損傷軟骨細胞的最適藥物濃度,并將該濃度用于后續(xù)實驗。6.通過MTT法檢測各組細胞的增殖活力,研究EDS對損傷軟骨細胞增殖的影響。7.通過流式細胞術(shù)檢測各組細胞的凋亡率,研究EDS對損傷軟骨細胞凋亡的影響。結(jié)果1.本實驗成功獲取了活性和純度均較高的原代軟骨細胞。2.EDS干預(yù)損傷軟骨細胞的最適藥物濃度為3μmol/L。3.與對照組相比,損傷組細胞的增殖活力明顯下降（P<0.05）;與損傷組相比,EDS干預(yù)組細胞的增殖活力明顯升高（P<0.05）;EDS干預(yù)組和對照組相比,細胞的增殖活力無顯著性差異（P>0.05）。4.與對照組相比,損傷組細胞的凋亡率明顯升高（P<0.05）;與損傷組相比,... 

【文章來源】：河南師范大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

實驗技術(shù)路線圖

3.5 實驗方法由于本課題研究主要是圍繞細胞實驗展開，因而在實驗過程中尤其是在進行單純的細胞實驗時必須嚴格要求在無菌的條件下完成；為更好的確保實驗在進行過程中的無菌環(huán)境，實驗時需要完成以下一些基本的操作：實驗于開始前務(wù)必穿戴專用工作服、一次性無菌乳膠手套和一次性口罩等；超凈工作臺在使用之前需要打開工作臺內(nèi)的紫外燈進行 30min 的紫外照射；超凈工作臺使用結(jié)束之后清理廢液缸并用無菌的 75%醫(yī)用酒精全面擦拭超凈工作臺的臺面 2 - 3 遍才可以將超凈工作臺關(guān)閉；進入細胞間后，應(yīng)用 75%醫(yī)用酒精噴壺適量噴灑自己的工作服和手套；每兩周必須對細胞間進行一次常規(guī)性的消毒；觀察細胞培養(yǎng)箱內(nèi)是否污染，定期更換細胞培養(yǎng)箱下托盤里的無菌超純水，對整個細胞培養(yǎng)箱進行 90℃高溫滅菌。下圖為本研究實驗環(huán)境及部分滅菌操作（圖 3-2）。

具體操作步驟如下。1) 將細胞培養(yǎng)瓶放于超凈工作臺內(nèi)，用無菌吸管吸取原來的細胞培養(yǎng)液，之后向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入 5ml 無菌的 PBS 磷酸緩沖液洗滌 3 遍。2) 棄去洗滌液并用加入 500μl 的 0.25%胰蛋白酶溶液，待絕大多數(shù)細胞的細胞形態(tài)由多角形逐漸變?yōu)榻鼒A形且有部分細胞漸漸處于非貼壁狀態(tài)時；迅速向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入3-5 ml 新鮮的低糖 DMEM 完全培養(yǎng)液，用以終止細胞的消化，完成后用移液槍輕輕反復(fù)的吹打培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞混合液，直至混合液基本形成單細胞懸液的狀態(tài)。3) 將得到的單細胞懸液按照體積為 1:2 或 1:3 的比例將其傳代至新的 25cm2細胞培養(yǎng)瓶，并且用低糖 DMEM 完全培養(yǎng)液將每個細胞培養(yǎng)瓶的液體補充至 5ml 左右；于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行常規(guī)的培養(yǎng)（原培養(yǎng)瓶可繼續(xù)使用，但使用時間不宜超過一個月）。綜上可知，細胞達到一定融合程度（圖 3-3A）時需要進行消化處理；細胞在消化過程中會出現(xiàn)從瓶底逐漸脫落并在懸浮液中游走的現(xiàn)象（圖 3-3B、圖 3-3C）；消化完成后基本所有的細胞從培養(yǎng)瓶壁上完全脫落，懸浮的細胞形態(tài)呈圓形（圖 3-3D）。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)蛻皮甾酮對H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的保護作用[J]. 郭長磊,呂風(fēng)華,王國戧.  中國免疫學(xué)雜志. 2017(11)
[2]蛻皮甾酮對UVB誘導(dǎo)HaCaT細胞損傷的保護作用[J]. 胡惠清,劉斌,李靜.  中國皮膚性病學(xué)雜志. 2017(07)
[3]定向結(jié)構(gòu)軟骨支架材料修復(fù)運動性關(guān)節(jié)軟骨損傷[J]. 趙霞,郭秋林.  中國組織工程研究. 2017(02)
[4]20-羥基蛻皮甾酮對膿毒癥小鼠心肌誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達的抑制[J]. 夏西超,劉慶春,王海鑫,張東獻,歸改霞,張東,劉榮志.  中華老年心腦血管病雜志. 2015(08)
[5]補腎活血方中4種有效成分對炎性因子釋放抑制活性研究[J]. 孫東東,沈衛(wèi)星,王卓,晏婷婷,程海波.  中華中醫(yī)藥雜志. 2015(08)
[6]人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的體外培養(yǎng)及細胞形態(tài)學(xué)分析[J]. 唐新,鄭果,黃強,李棋,付維力,李箭,陳剛,周宗科,裴福興.  實用骨科雜志. 2015(07)
[7]彭力平教授論治膝骨痹學(xué)術(shù)經(jīng)驗[J]. 楊洪杰.  甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 2015(03)
[8]日本大耳兔關(guān)節(jié)軟骨細胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J]. 耿書國,王麗麗,汪建樣,施劍明,殷嫦嫦.  九江學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版). 2015(02)
[9]兔軟骨細胞的體外分離、培養(yǎng)及鑒定[J]. 王林林,董玉珍.  新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 2015(04)
[10]Ⅱ型膠原酶消化法培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細胞[J]. 閆虎,蘇友新,林學(xué)義,陳寶軍,周必洪,張慶.  中國組織工程研究. 2013(50)

博士論文
[1]生物活性材料促進關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)和再生研究[D]. 張薇.浙江大學(xué) 2015
[2]川芎嗪治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的臨床觀察及對兔關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖與凋亡的影響[D]. 洪昆達.福建中醫(yī)藥大學(xué) 2013

碩士論文
[1]牛膝提取物—蛻皮甾酮對脂多糖誘導(dǎo)兔軟骨細胞損傷的保護作用[D]. 王剛濤.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 2015
[2]凋亡與增殖相關(guān)基因在損傷兔關(guān)節(jié)軟骨細胞中的表達變化[D]. 馬子君.蚌埠醫(yī)學(xué)院 2014



本文編號：3301640