目的探討蛻皮甾酮（Ecdysterone,EDS）對損傷軟骨細胞增殖與凋亡的影響及其作用機制。方法1.手術分離SD大鼠膝關節(jié)股骨下端關節(jié)面軟骨組織。2.采用0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅱ型膠原蛋白酶共同消化法獲取原代細胞。3.采用形態(tài)學觀察、甲苯胺藍染色和Ⅱ型膠原免疫熒光染色的方法鑒定細胞。4.采用細胞劃傷的方法構建損傷軟骨細胞模型,模擬軟骨損傷的生物學變化。5.篩選EDS作用于損傷軟骨細胞的最適藥物濃度,并將該濃度用于后續(xù)實驗。6.通過MTT法檢測各組細胞的增殖活力,研究EDS對損傷軟骨細胞增殖的影響。7.通過流式細胞術檢測各組細胞的凋亡率,研究EDS對損傷軟骨細胞凋亡的影響。結果1.本實驗成功獲取了活性和純度均較高的原代軟骨細胞。2.EDS干預損傷軟骨細胞的最適藥物濃度為3μmol/L。3.與對照組相比,損傷組細胞的增殖活力明顯下降（P<0.05）;與損傷組相比,EDS干預組細胞的增殖活力明顯升高（P<0.05）;EDS干預組和對照組相比,細胞的增殖活力無顯著性差異（P>0.05）。4.與對照組相比,損傷組細胞的凋亡率明顯升高（P<0.05）;與損傷組相比,... 

【文章來源】：河南師范大學河南省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

實驗技術路線圖

3.5 實驗方法由于本課題研究主要是圍繞細胞實驗展開，因而在實驗過程中尤其是在進行單純的細胞實驗時必須嚴格要求在無菌的條件下完成；為更好的確保實驗在進行過程中的無菌環(huán)境，實驗時需要完成以下一些基本的操作：實驗于開始前務必穿戴專用工作服、一次性無菌乳膠手套和一次性口罩等；超凈工作臺在使用之前需要打開工作臺內的紫外燈進行 30min 的紫外照射；超凈工作臺使用結束之后清理廢液缸并用無菌的 75%醫(yī)用酒精全面擦拭超凈工作臺的臺面 2 - 3 遍才可以將超凈工作臺關閉；進入細胞間后，應用 75%醫(yī)用酒精噴壺適量噴灑自己的工作服和手套；每兩周必須對細胞間進行一次常規(guī)性的消毒；觀察細胞培養(yǎng)箱內是否污染，定期更換細胞培養(yǎng)箱下托盤里的無菌超純水，對整個細胞培養(yǎng)箱進行 90℃高溫滅菌。下圖為本研究實驗環(huán)境及部分滅菌操作（圖 3-2）。

具體操作步驟如下。1) 將細胞培養(yǎng)瓶放于超凈工作臺內，用無菌吸管吸取原來的細胞培養(yǎng)液，之后向培養(yǎng)瓶內加入 5ml 無菌的 PBS 磷酸緩沖液洗滌 3 遍。2) 棄去洗滌液并用加入 500μl 的 0.25%胰蛋白酶溶液，待絕大多數(shù)細胞的細胞形態(tài)由多角形逐漸變?yōu)榻鼒A形且有部分細胞漸漸處于非貼壁狀態(tài)時；迅速向培養(yǎng)瓶內加入3-5 ml 新鮮的低糖 DMEM 完全培養(yǎng)液，用以終止細胞的消化，完成后用移液槍輕輕反復的吹打培養(yǎng)瓶內細胞混合液，直至混合液基本形成單細胞懸液的狀態(tài)。3) 將得到的單細胞懸液按照體積為 1:2 或 1:3 的比例將其傳代至新的 25cm2細胞培養(yǎng)瓶，并且用低糖 DMEM 完全培養(yǎng)液將每個細胞培養(yǎng)瓶的液體補充至 5ml 左右；于細胞培養(yǎng)箱內進行常規(guī)的培養(yǎng)（原培養(yǎng)瓶可繼續(xù)使用，但使用時間不宜超過一個月）。綜上可知，細胞達到一定融合程度（圖 3-3A）時需要進行消化處理；細胞在消化過程中會出現(xiàn)從瓶底逐漸脫落并在懸浮液中游走的現(xiàn)象（圖 3-3B、圖 3-3C）；消化完成后基本所有的細胞從培養(yǎng)瓶壁上完全脫落，懸浮的細胞形態(tài)呈圓形（圖 3-3D）。

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]牛膝提取物—蛻皮甾酮對脂多糖誘導兔軟骨細胞損傷的保護作用[D]. 王剛濤.新鄉(xiāng)醫(yī)學院 2015
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本文編號：3301640