目的:耐輻射球菌（Deinococcus radiodurans）（簡稱DR）是一種對電離輻射,紫外線,強(qiáng)氧化劑和化學(xué)誘變劑具有超強(qiáng)耐受力的極端微生物,是迄今為止地球上發(fā)現(xiàn)的抗輻射能力最強(qiáng)的生物之一。最近研究表明,負(fù)責(zé)這一抗性的開關(guān)基因—pprI基因在DNA損傷修復(fù)中起著極為重要的作用。pprI基因可作為一個保護(hù)開關(guān)基因誘導(dǎo)DNA修復(fù)基因如recA和pprA的表達(dá),在提高細(xì)胞抗氧化能力方面,也可能通過調(diào)控過氧化氫酶的表達(dá)活性來提高抗H2O2的能力。我們近年的研究表明,pprI基因轉(zhuǎn)染對哺乳動物中子和γ射線急性放射損傷具有顯著的防治作用。然而,基因轉(zhuǎn)染用于放射損傷的防治存在一定的困難和局限性。因此,本課題進(jìn)一步研究pprI基因原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建、PprI蛋白的表達(dá)及其純化,并將其注入受照小鼠體內(nèi),研究PprI蛋白對小鼠γ射線急性放射損傷的防治作用。耐輻射球菌pprI基因表達(dá)的PprI原核蛋白對真核生物的抗放作用,迄今尚未見國內(nèi)外文獻(xiàn)報道。材料與方法:以我們已獲得國家發(fā)明專利的pCMV-HA-pprI質(zhì)粒為模板,構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-His-pprI,并轉(zhuǎn)化入E. coli ... 

【文章來源】：蘇州大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

PprI基因PCR產(chǎn)物電泳圖

圖 2. PprI 基因煮菌驗證電泳圖注：1~14：煮菌驗證產(chǎn)物2.重組原核表達(dá)質(zhì)粒的測序鑒定選取初步鑒定顯示陽性結(jié)果的質(zhì)粒送測序，測序結(jié)果與 NCBI 公布的 pprI 基因堿基序列進(jìn)行比對，顯示二者堿基序列完全一致。三、表達(dá)產(chǎn)物的鑒定圖 3 SDS-PAGE 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)后，菌體總蛋白在37KD 處有一條新帶，而未經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)的菌中未發(fā)現(xiàn)此帶。同時，SDS-PAGE 結(jié)果顯示不同誘導(dǎo)濃度、溫度和時間在相對分子量為 37KD 處見到特異性的 PprI 蛋白條帶具有一定的差異，IPTG2mmol/L 較 1 mmol/L 誘導(dǎo)后目的蛋白條帶增粗，IPTG 誘導(dǎo) 6h 較 4h 后目的蛋白條帶增粗，37℃誘導(dǎo)較 25℃誘導(dǎo)后蛋白條帶增粗。

圖 3 表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE 分析（考馬斯亮藍(lán)染色）注：1~3: IPTG2mmol/L，25℃分別誘導(dǎo) 0，4，6h ；4~6: IPTG1mmol/L，25℃分別誘導(dǎo) 0，4，6h；7~9: IPTG2mmol/L，37℃分別誘導(dǎo) 0，4，6h ；10~12: IPTG1mmol/L，37℃分別誘導(dǎo) 0，4，6h四、純化融合蛋白的 Western blotting 鑒定Western blotting 分析表明，含有 His-PprI 融合蛋白的 2、3、4、6、7 可與 His抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，見圖 4。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號：3124918