研究目的:哺乳動物配子間的識別始于卵透明帶(zona pellucida,ZP)與精子之間的結(jié)合。人類的ZP主要由四種糖蛋白組成,分別是ZP1,ZP2,ZP3和ZP4。其中,人卵膜糖蛋白3(h ZP3)作為精卵結(jié)合的初始受體,在誘導(dǎo)精子頂體反應(yīng)的同時也表現(xiàn)出與精子較強的結(jié)合能力。由于天然h ZP3較難獲取,目前大多數(shù)研究集中在重組h ZP3體外與獲能精子的結(jié)合,但尚未有關(guān)于原核表達h ZP3體外與未獲能精子結(jié)合的相關(guān)研究報道,同時,國內(nèi)針對抗h ZP3全長特異性抗體的研究較少。因此,依據(jù)精卵結(jié)合的特性以及精卵受體配體間的相互作用,本研究欲通過原核表達的重組h ZP3體外與未獲能精子的結(jié)合,為本課題組后續(xù)在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域從混合斑中提取精子細胞提供應(yīng)用基礎(chǔ);以及利用純化后的重組h ZP3為抗原,制備抗h ZP3抗血清,為后續(xù)實驗提供材料基礎(chǔ)。研究方法:利用構(gòu)建的p GEX-4T-1-h ZP3-His原核表達質(zhì)粒,通過大腸桿菌誘導(dǎo)表達出h ZP3-GST-His融合蛋白;利用谷胱甘肽瓊脂糖樹脂(GST Resin)親和層析純化該蛋白。利用純化后的h ZP3免疫新西蘭白兔制備抗血清,分別采用ELISA和蛋白免疫印跡分析檢測兔抗血清效價及特異性。純化后的h ZP3與未獲能精子體外結(jié)合,通過免疫熒光技術(shù)檢測h ZP3與精子共定位,利用抑制實驗檢測h ZP3與精子的結(jié)合效率。實驗結(jié)果:1、在大腸桿菌中成功表達出h ZP3-GST-His融合蛋白;純化得到分子質(zhì)量約為73 k Da的特異性的重組h ZP3;2、以純化后重組h ZP3免疫新西蘭白兔獲得抗h ZP3的高效價粗制多克隆抗血清,但特異性較差;3、免疫熒光結(jié)果未發(fā)現(xiàn)原核表達的重組h ZP3在體外與未獲能精子進行結(jié)合;抑制實驗結(jié)果顯示重組h ZP3與精子呈現(xiàn)出一定程度的結(jié)合趨勢。結(jié)論:成功表達并純化出重組hZP3;制備的兔抗hZP3的抗血清抗體效價較高,但特異性較差;重組h ZP3在體外與未獲能人精子顯示出較弱的結(jié)合。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：D919.4
【部分圖文】：

A 組加入 1：5000 稀釋的羊抗鼠 IgG（HRP）每孔 100 μl； 1：5000 稀釋的羊抗兔 IgG（HRP）作為二抗，每孔 100 μl；37℃下反應(yīng)之后操作與 2.2.3.2 一致。3 實驗結(jié)果 重組 hZP3 的誘導(dǎo)表達及純化結(jié)果1 pGEX-4T-1(+)- hZP3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果按上述實驗方法，經(jīng) 1%瓊脂糖電泳后，酶切后重組質(zhì)粒產(chǎn)生兩條亮帶，分bp 和 2252bp（如圖 1 所示）。經(jīng)比對質(zhì)粒、hZP3 的序列，酶切位置與理符，結(jié)果表明該原核表達載體 pGEX-4T-1-hZP3 構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3.1.2 大腸桿菌 BL21（DE3）成功表達重組 hZP3轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒 pGEX-4T-1(+)-hZP3 的大腸桿菌 BL21（DE3）經(jīng)不同的 IPTG 濃度（0.5、1.0、1.5mM）（圖 2）、誘導(dǎo)時間（4、6h）（圖 3）和誘導(dǎo)溫度（28℃、37℃）（圖 4）進行誘導(dǎo)條件摸索，優(yōu)化出最佳表達條件。結(jié)果如圖 2~4 所示，總體分析可得重組菌 pGEX-4T-1(+)-hZP3 的最佳 IPTG 誘導(dǎo)濃度為 1.5mM，誘導(dǎo)時間為 6 h，誘導(dǎo)溫度為 28℃。

37℃）（圖 4）進行誘導(dǎo)條件摸索，優(yōu)化出最佳表達條件。結(jié)果如圖 2~4 所示，總體分析可得重組菌 pGEX-4T-1(+)-hZP3 的最佳 IPTG 誘導(dǎo)濃度為 1.5mM，誘導(dǎo)時間為 6 h，誘導(dǎo)溫度為 28℃。圖 2 在 0.5、1.0、1.5mM IPTG 誘導(dǎo)濃度下重組菌表達蛋白的免疫印跡分析M：蛋白 Marker；泳道 1-1，2-1，3-1 分別是在 IPTG 誘導(dǎo)濃度為 0.5、1.0、1.5mM 時的破菌后上清，泳道 1-2，2-2，3-2 分別是在 IPTG 誘導(dǎo)濃度為 0.5、1.0、1.5mM 時的破菌后沉淀。
【參考文獻】

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1 盧慧;刁華;肖玉芳;于合國;李錚;施惠娟;;昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)表達重組人類ZP3蛋白的研究[J];中華男科學(xué)雜志;2014年11期

本文編號：2886784