【摘要】：目的:IER5(Immediate early response 5)作于慢動力早期反應基因家族中的一員,其廣泛存在于人體各組織臟器中,且在消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)腫瘤組織中較癌旁組織呈現(xiàn)較高表達,IER5的表達可能與惡性腫瘤的不良預后有關。在前期研究中,IER5的表達抑制促進HeLa細胞的增殖并減輕輻射誘導的增殖抑制,從而增加其輻射抗性。相反,IER5過表達擾亂了細胞周期檢查點并使細胞產(chǎn)生輻射敏感性。然而,IER5在調(diào)節(jié)細胞周期中的信號途徑和機制仍不清楚。本論文主要圍繞受輻射影響上調(diào)的IER5如何進行周期表達調(diào)控這一主線,找出受IER5影響的一個關鍵細胞周期調(diào)控蛋白——Cdc25B,以Cdc25B為突破口探索IER5在放射損傷細胞周期調(diào)控反應中的作用及具體機制。方法:(1)對IER5正常的HeLa細胞和沉默IER5的HeLa細胞分別進行4Gy γ射線照射,于照射后不同的時間點收取細胞總RNA和總蛋白,進行qPCR和Western Blotting實驗,檢測IER5及Cdc25B mRNA及蛋白水平變化,分析輻照后二者間的表達關系。(2)構建Cdc25B基因啟動子雙熒光素酶重組質(zhì)粒,查看輻照對Cdc25B轉(zhuǎn)錄活性的影響,找到受輻射影響的反應元件存在的啟動子區(qū)域。對這一區(qū)域進行生物信息分析,采用重疊延伸技術進行特定位點突變。進一步明確這些特定位點在輻射介導的Cdc25B調(diào)控中所起的作用。(3)在293T細胞中,利用Cdc25B基因啟動子雙熒光素酶重組質(zhì)粒和IER5表達質(zhì)粒,檢測IER5是否與Cdc25B啟動子存在相互作用及相互作用區(qū)域。(4)在HeLa細胞中,瞬時轉(zhuǎn)染點突變質(zhì)粒的同時利用siRNA敲降IER5,查看IER5是否可以通過特異位點參與輻射介導的Cdc25B表達調(diào)控。(5)通過ChIP-PCR查看輻射后Cdc25B啟動子區(qū)IER5、Sp1、Sp3、NF-YB關鍵轉(zhuǎn)錄因子的富集效率變化。在HeLa細胞中,利用siRNA敲降IER5,查看IER5敲降是否影響輻射介導的Cdc25B這幾個關鍵轉(zhuǎn)錄因子變化。(6)通過qPCR和Western Blotting實驗查看IER5和NF-YB共敲降是否能夠阻斷NF-YB敲降引起的Cdc25B下調(diào)。結果:(1)HeLa細胞與沉默IER5的HeLa細胞經(jīng)60Coγ射線照射后,IER5與Cdc25B間存在表達變化相反趨勢。但沉默IER5的HeLa細胞Cdc25B在8h下調(diào)比例明顯減少(0.225倍vs 0.662倍,P0.01)。因此,認為輻射引起的IER5表達上調(diào)對輻射引起的Cdc25B表達下調(diào)存在調(diào)控作用。(2)利用構建成功的Cdc25B基因啟動子雙熒光素酶重組質(zhì)粒,輻射后Cdc25B啟動子活性明顯降低(P0.001),且受輻射影響的反應元件存在于Cdc25B啟動子的-160～-53區(qū)域內(nèi)。突變該區(qū)域內(nèi)特異位點,發(fā)現(xiàn)輻射后Sp1/Sp3突變和NF-YB突變的啟動子活性降低(P0.05),但并未引起SP1/SP3和NF-YB聯(lián)合突變啟動子活性明顯變化。這表明,Sp1/Sp3和NF-YB結合位點均參與了輻射介導的Cdc25B表達調(diào)控。(3)IER5表達能夠明顯降低Cdc25B轉(zhuǎn)錄活性(P0.001),且受IER5表達影響的反應元件也存在于-160～-53區(qū)域內(nèi)。IER5過表達通過NF-YB結合位點降低Cdc25B基因啟動子的活性。(4)IER5通過NF-YB結合位點參與輻射介導的Cdc25B表達調(diào)控。(5)通過ChIP-PCR凝膠電泳顯示:IER5蛋白結合在Cdc25B啟動子上。與不接受照射相比Sp1、Sp3、NF-YB在照射后富集效率均出現(xiàn)明顯下降(P0.01),反而IER5在照射后富集效率上升(P0.01)。p300作為已知的與NF-YB相互作用的共激活因子,輻照后p300也顯著釋放(P0.01)。IER5敲降后阻斷了輻射引起的NF-YB結合釋放。(6)通過qPCR和Western Blotting實驗查看IER5和NF-YB共敲降能夠明顯阻斷NF-YB敲降引起的Cdc25B下調(diào)。結論:在HeLa細胞中輻照引起IER5表達上調(diào),通過從Cdc25B啟動子區(qū)釋放NF-YB而結合更多的IER5對其進行轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控。
【圖文】：

為表征輻照后ＩＥＲ５與Ｃｄｃ２５Ｂ間的關系，首先對處于對數(shù)生長期的ＨｅＬａ細胞逡逑采�。矗牵澹偕渚�照射，輻照后分別在０．５邋ｈ、４邋ｈ、８邋ｈ、１２邋ｈ、２４邋ｈ查看ＩＥＲ５與Ｃｄｃ２５Ｂ逡逑間的ｍＲＮＡ及蛋白水平變化。如圖３．１邋Ａ－Ｂ所示，發(fā)現(xiàn)ＩＥＲ５在４邋ｈ起即表達上調(diào)，逡逑８ｈ上調(diào)比例最大，１２ｈ上調(diào)比例略有下降。但Ｃｄｃ２５Ｂ在４ｈ以后出現(xiàn)明顯的表達逡逑下調(diào)，１２ｈ下調(diào)比例最明顯，在８ｈ下調(diào)比例為０．２２５±０．邋０７２倍。逡逑Ａ邐Ｂ邐Ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ逡逑ＩＲ邋（４Ｇｙ）逡逑Ｔｉｍｅ／ｈ邋￣￣＾邐ｇ邐￣２￣￣邐５＂１邐ＩＥＲ５邋Ｃｄｃ２５Ｂ邋ｒ１．５逡逑ＩＥＲ５｜—邐ｐ，４－邐＾，ｇ逡逑邐邋￡邋１３－逡逑Ｃｄｃ２５Ｂ邋—ｐ邐一邋．邋ｇ邋＜邐＼Ｖ邐．邐＞邋ｃｄ逡逑邐邋邐邐邋Ｊｖ．．

Ｆｉｇｕｒｅ邋３．３．邋Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｃｄｃ２５Ｂ邋ｇｅｎｅ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ逡逑接著，，我們利用ＰＣＲ反應克隆獲取Ｃｄｃ２５Ｂ基因啟動子片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電逡逑泳檢測發(fā)現(xiàn)在２，０００邋ｂｐ附近可見單一條帶，見圖３．４邋Ａ，這恰好與調(diào)�。茫洌悖玻担禄蝈义蠁幼悠未笮⊥耆喾⑵淇寺≈岭p熒光素酶通用載體ｐＧＬ３－Ｂａｓｉｃ上。酶切驗逡逑證可在２，０００邋ｂｐ和５，０００邋ｂｐ附近出現(xiàn)兩條清晰條帶，這與插入的目的片段和線性通逡逑用載體大小完全一致，見圖３．４邋Ｂ。經(jīng)測序比對后，與目的片段的理論序列完全一致，逡逑質(zhì)粒構建正確，將其命名為ｐＧＬ３－Ｃｄｃ２５Ｂ＿１９３０。逡逑為進一步明確Ｃｄｃ２５Ｂ基因特異調(diào)控的具體區(qū)域，以構建成功的逡逑ｐＧＬ３－Ｃｄｃ２５Ｂ＿１９３０質(zhì)粒為模板，利用ＰＣＲ反應擴增出６條啟動子缺失片段，如圖逡逑３．４Ｃ所示。分別將其克隆至雙熒光素酶通用載體ｐＧＬ３－Ｂａｓｉｃ上。酶切驗證，如圖逡逑３．４邋Ｄ所示。系列缺失重組質(zhì)粒均可雙酶切得到大小正確的條帶，經(jīng)測序比對與理論逡逑序列完全一致
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R818

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 張晨,黃世林,馬東初,孫英慧,馬小鋒;硫化砷誘導NB_4細胞調(diào)亡[J];白血病;2000年06期

2 丁志山，沃興德;細胞調(diào)亡與動脈粥樣硬化[J];中國動脈硬化雜志;1998年01期

3 ;細胞的一生[J];少兒科學周刊(兒童版);2018年06期

4 張哲;謝玨;;骨髓增生異常綜合征患者CD34~+細胞Fas、FasL及Bcl-2的表達和凋亡的研究[J];浙江檢驗醫(yī)學;2003年03期

5 ;肝癌和細胞調(diào)亡[J];國外醫(yī)學.外科學分冊;1997年01期

6 石雪蓉;;抗腫瘤中藥的研究現(xiàn)狀[J];四川解剖學雜志;2009年03期

7 劉怡平,彭惠,彭蘭文;細胞凋亡與Fas系統(tǒng)[J];醫(yī)學綜述;2003年12期

8 陳獻華,徐紅,李莉,黃青山;人肝癌細胞移植瘤QGY-9204中細胞調(diào)亡和壞死并存現(xiàn)象的初步分析[J];復旦學報(自然科學版);1999年06期

9 魏愛麗;龍隆;李微;丁銳;陳偉;王莉莉;;基于細胞高內(nèi)涵分析表征氮芥HN-3的細胞毒性[J];中國藥理學與毒理學雜志;2017年07期

10 羅靜;趙艷;謝婧雯;劉鑫;林芳波;侯德仁;;敲低SORL1表達構建模擬阿爾茨海默病的細胞模型[J];南方醫(yī)科大學學報;2018年01期

相關會議論文 前10條

1 陳衛(wèi)銀;祝彼得;劉福友;馮雪梅;;參芎滴丸對急性腦梗死模型大鼠神經(jīng)細胞調(diào)亡的影響[A];中華醫(yī)學會第十三次全國神經(jīng)病學學術會議論文匯編[C];2010年

2 謝晶日;李威;梁國英;楊豐源;;胃靈顆粒對胃癌前病變細胞調(diào)亡基因影響的實驗研究[A];中華中醫(yī)藥學會脾胃病分會第十八次學術交流會論文匯編[C];2006年

3 周霞;王左;李文濤;魏江磊;;生地注射液抗凝血酶所致星形膠質(zhì)細胞調(diào)亡的實驗研究[A];山東省第三次中西醫(yī)結合神經(jīng)內(nèi)科學術研討會論文匯編[C];2011年

4 崔承彬;閆少羽;蔡兵;趙慶春;姚新生;曲戈霞;;黑果黃皮Clausena dunniana Levl中咔唑生物堿類新細胞周期抑制劑及細胞調(diào)亡誘導劑的核磁共振研究[A];第十一屆全國波譜學學術會議論文摘要集[C];2000年

5 吳李君;裴蓓;王順昌;王軍;湯明禮;;砷和鎘暴露誘導秀麗小桿線蟲生殖腺細胞調(diào)亡及其信號通路研究[A];中國毒理學會第二屆全國中青年學者科技論壇會議論文集[C];2007年

6 冉新澤;鄭懷恩;王艾平;王鋒超;韓京;;他汀對內(nèi)皮細胞輻射損傷組織因子與細胞調(diào)亡的影響[A];中國毒理學會放射毒理專業(yè)委員會第七次、中國毒理學會免疫毒理專業(yè)委員會第五次、中國環(huán)境誘變劑學會致突專業(yè)委員會第二次、中國環(huán)境誘變劑學會致畸專業(yè)委員會第二次、中國環(huán)境誘變劑學會致癌專業(yè)委員會第二次全國學術會議論文匯編[C];2008年

7 崔承彬;趙慶春;蔡兵;姚新生;曲弋霞;;粗葉懸鉤子Rubus aleaefolius Poir抗癌活性成分的研究——Ⅰ多酚類新細胞周期抑制劑及細胞調(diào)亡誘導劑[A];全國中藥研究與開發(fā)學術研討會論文摘要集[C];2001年

8 崔承彬;王浩;韓冰;宋幼新;;假輪枝鏈霉菌Streptomyces pseudoverticilus生產(chǎn)的洋橄欖葉素類新細胞周期抑制劑及細胞調(diào)亡誘導劑的核磁共振研究[A];第十一屆全國波譜學學術會議論文摘要集[C];2000年

9 崔承彬;閆少羽;蔡兵;趙慶春;姚新生;曲弋霞;;黑果黃皮Clausena dunniana Levl抗癌活性成分的研究——Ⅰ咔唑生物堿類新細胞周期抑制劑及細胞調(diào)亡誘導劑[A];全國中藥研究與開發(fā)學術研討會論文摘要集[C];2001年

10 成志;高瑞蘭;陳小紅;金錦梅;;β-七葉皂苷誘導HL-60細胞調(diào)亡的研究[A];第11次中國實驗血液學會議論文匯編[C];2007年

相關重要報紙文章 前3條

1 張?zhí)锟?細胞調(diào)亡的意義[N];中國人口報;2002年

2 科;抗真菌藥物可優(yōu)先導致癌癥細胞調(diào)亡[N];中國高新技術產(chǎn)業(yè)導報;2001年

3 李大慶 胡凌凌;科研發(fā)展:公平競爭最關鍵[N];科技日報;2004年

相關博士學位論文 前10條

1 李辰;Cx43在血管內(nèi)皮細胞輻射損傷調(diào)控中的作用及其機制研究[D];中國疾病預防控制中心;2019年

2 俞曉亮;人類單純皰疹病毒調(diào)節(jié)細胞程序性壞死的機制研究[D];蘇州大學;2018年

3 王東陽;一種新的PGRN結合蛋白-FAM76B蛋白的功能研究[D];陜西師范大學;2015年

4 李清;二氫卟吩e6介導的聲光聯(lián)合療法對小鼠乳腺癌4T1細胞殺傷效應的研究[D];陜西師范大學;2013年

5 張蕊;線粒體轉(zhuǎn)錄因子A對腫瘤細胞輻射敏感性的影響及相關機制研究[D];中國科學技術大學;2019年

6 牛坤偉;BAP31對T細胞發(fā)育及其功能影響的研究[D];東北大學;2017年

7 夏菁;剛地弓形蟲毒力因子ROP18與人細胞互作蛋白質(zhì)組學分析及Ⅰ型ROP18結合人NMI蛋白干擾其功能的機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2019年

8 李雪;Helios在急性淋巴細胞白血病調(diào)節(jié)性T細胞中的表達及調(diào)控機制的研究[D];山東大學;2019年

9 何雨珂;抑制性受體TIGIT對NK細胞“教育”的調(diào)控作用[D];中國科學技術大學;2017年

10 王海萍;新型敏化劑DVDMS聲動力抗腫瘤實驗研究[D];陜西師范大學;2017年

相關碩士學位論文 前10條

1 丁立新;IER5在放射損傷HeLa細胞中對Cdc25B基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制研究[D];中國疾病預防控制中心;2019年

2 鄭帥;利用光聲和熒光成像技術在體內(nèi)追蹤染料標記的T細胞在疾病部位的免疫活動[D];廈門大學;2018年

3 姜璐;Brd4抑制劑JQ1對化療藥物DOX殺傷腫瘤細胞的增敏效應[D];廈門大學;2017年

4 張運超;四溴雙酚A對人體正常肝細胞（L02）的毒性作用及機理[D];華東理工大學;2019年

5 謝佳汛;p53影響偽狂犬病毒在PK-15細胞中復制的研究[D];廣西大學;2018年

6 邢月曉;基于核磁共振代謝組學的大黃素對HepG2細胞抗癌活性研究[D];南京理工大學;2018年

7 朱亞男;LncRNA Lincpint影響T2DM小鼠胰島β細胞功能損傷的初步研究[D];南京醫(yī)科大學;2016年

8 李明月;腫瘤細胞中PRMT5和PRMT1調(diào)控CFLAR_L的分子機制[D];山東大學;2018年

9 田冰;索拉非尼聯(lián)用貝沙羅汀對原發(fā)性肝癌的協(xié)同抑制作用及機制研究[D];山東大學;2018年

10 朱振浩;微環(huán)境中MDSCs異常分化與腫瘤細胞OXA藥物反應的關聯(lián)及機制初探[D];南方醫(yī)科大學;2018年

本文編號：2666523