【摘要】：目的:IER5(Immediate early response 5)作于慢動(dòng)力早期反應(yīng)基因家族中的一員,其廣泛存在于人體各組織臟器中,且在消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)腫瘤組織中較癌旁組織呈現(xiàn)較高表達(dá),IER5的表達(dá)可能與惡性腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)。在前期研究中,IER5的表達(dá)抑制促進(jìn)HeLa細(xì)胞的增殖并減輕輻射誘導(dǎo)的增殖抑制,從而增加其輻射抗性。相反,IER5過表達(dá)擾亂了細(xì)胞周期檢查點(diǎn)并使細(xì)胞產(chǎn)生輻射敏感性。然而,IER5在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中的信號途徑和機(jī)制仍不清楚。本論文主要圍繞受輻射影響上調(diào)的IER5如何進(jìn)行周期表達(dá)調(diào)控這一主線,找出受IER5影響的一個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞周期調(diào)控蛋白——Cdc25B,以Cdc25B為突破口探索IER5在放射損傷細(xì)胞周期調(diào)控反應(yīng)中的作用及具體機(jī)制。方法:(1)對IER5正常的HeLa細(xì)胞和沉默IER5的HeLa細(xì)胞分別進(jìn)行4Gy γ射線照射,于照射后不同的時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞總RNA和總蛋白,進(jìn)行qPCR和Western Blotting實(shí)驗(yàn),檢測IER5及Cdc25B mRNA及蛋白水平變化,分析輻照后二者間的表達(dá)關(guān)系。(2)構(gòu)建Cdc25B基因啟動(dòng)子雙熒光素酶重組質(zhì)粒,查看輻照對Cdc25B轉(zhuǎn)錄活性的影響,找到受輻射影響的反應(yīng)元件存在的啟動(dòng)子區(qū)域。對這一區(qū)域進(jìn)行生物信息分析,采用重疊延伸技術(shù)進(jìn)行特定位點(diǎn)突變。進(jìn)一步明確這些特定位點(diǎn)在輻射介導(dǎo)的Cdc25B調(diào)控中所起的作用。(3)在293T細(xì)胞中,利用Cdc25B基因啟動(dòng)子雙熒光素酶重組質(zhì)粒和IER5表達(dá)質(zhì)粒,檢測IER5是否與Cdc25B啟動(dòng)子存在相互作用及相互作用區(qū)域。(4)在HeLa細(xì)胞中,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染點(diǎn)突變質(zhì)粒的同時(shí)利用siRNA敲降IER5,查看IER5是否可以通過特異位點(diǎn)參與輻射介導(dǎo)的Cdc25B表達(dá)調(diào)控。(5)通過ChIP-PCR查看輻射后Cdc25B啟動(dòng)子區(qū)IER5、Sp1、Sp3、NF-YB關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的富集效率變化。在HeLa細(xì)胞中,利用siRNA敲降IER5,查看IER5敲降是否影響輻射介導(dǎo)的Cdc25B這幾個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子變化。(6)通過qPCR和Western Blotting實(shí)驗(yàn)查看IER5和NF-YB共敲降是否能夠阻斷NF-YB敲降引起的Cdc25B下調(diào)。結(jié)果:(1)HeLa細(xì)胞與沉默IER5的HeLa細(xì)胞經(jīng)60Coγ射線照射后,IER5與Cdc25B間存在表達(dá)變化相反趨勢。但沉默IER5的HeLa細(xì)胞Cdc25B在8h下調(diào)比例明顯減少(0.225倍vs 0.662倍,P0.01)。因此,認(rèn)為輻射引起的IER5表達(dá)上調(diào)對輻射引起的Cdc25B表達(dá)下調(diào)存在調(diào)控作用。(2)利用構(gòu)建成功的Cdc25B基因啟動(dòng)子雙熒光素酶重組質(zhì)粒,輻射后Cdc25B啟動(dòng)子活性明顯降低(P0.001),且受輻射影響的反應(yīng)元件存在于Cdc25B啟動(dòng)子的-160～-53區(qū)域內(nèi)。突變該區(qū)域內(nèi)特異位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)輻射后Sp1/Sp3突變和NF-YB突變的啟動(dòng)子活性降低(P0.05),但并未引起SP1/SP3和NF-YB聯(lián)合突變啟動(dòng)子活性明顯變化。這表明,Sp1/Sp3和NF-YB結(jié)合位點(diǎn)均參與了輻射介導(dǎo)的Cdc25B表達(dá)調(diào)控。(3)IER5表達(dá)能夠明顯降低Cdc25B轉(zhuǎn)錄活性(P0.001),且受IER5表達(dá)影響的反應(yīng)元件也存在于-160～-53區(qū)域內(nèi)。IER5過表達(dá)通過NF-YB結(jié)合位點(diǎn)降低Cdc25B基因啟動(dòng)子的活性。(4)IER5通過NF-YB結(jié)合位點(diǎn)參與輻射介導(dǎo)的Cdc25B表達(dá)調(diào)控。(5)通過ChIP-PCR凝膠電泳顯示:IER5蛋白結(jié)合在Cdc25B啟動(dòng)子上。與不接受照射相比Sp1、Sp3、NF-YB在照射后富集效率均出現(xiàn)明顯下降(P0.01),反而IER5在照射后富集效率上升(P0.01)。p300作為已知的與NF-YB相互作用的共激活因子,輻照后p300也顯著釋放(P0.01)。IER5敲降后阻斷了輻射引起的NF-YB結(jié)合釋放。(6)通過qPCR和Western Blotting實(shí)驗(yàn)查看IER5和NF-YB共敲降能夠明顯阻斷NF-YB敲降引起的Cdc25B下調(diào)。結(jié)論:在HeLa細(xì)胞中輻照引起IER5表達(dá)上調(diào),通過從Cdc25B啟動(dòng)子區(qū)釋放NF-YB而結(jié)合更多的IER5對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄抑制調(diào)控。
【圖文】：

為表征輻照后ＩＥＲ５與Ｃｄｃ２５Ｂ間的關(guān)系，首先對處于對數(shù)生長期的ＨｅＬａ細(xì)胞逡逑采�。矗牵澹偕渚�照射，輻照后分別在０．５邋ｈ、４邋ｈ、８邋ｈ、１２邋ｈ、２４邋ｈ查看ＩＥＲ５與Ｃｄｃ２５Ｂ逡逑間的ｍＲＮＡ及蛋白水平變化。如圖３．１邋Ａ－Ｂ所示，發(fā)現(xiàn)ＩＥＲ５在４邋ｈ起即表達(dá)上調(diào)，逡逑８ｈ上調(diào)比例最大，１２ｈ上調(diào)比例略有下降。但Ｃｄｃ２５Ｂ在４ｈ以后出現(xiàn)明顯的表達(dá)逡逑下調(diào)，１２ｈ下調(diào)比例最明顯，在８ｈ下調(diào)比例為０．２２５±０．邋０７２倍。逡逑Ａ邐Ｂ邐Ｒｅａｌ邋ｔｉｍｅＲＴ－ＰＣＲ逡逑ＩＲ邋（４Ｇｙ）逡逑Ｔｉｍｅ／ｈ邋￣￣＾邐ｇ邐￣２￣￣邐５＂１邐ＩＥＲ５邋Ｃｄｃ２５Ｂ邋ｒ１．５逡逑ＩＥＲ５｜—邐ｐ，４－邐＾，ｇ逡逑邐邋￡邋１３－逡逑Ｃｄｃ２５Ｂ邋—ｐ邐一邋．邋ｇ邋＜邐＼Ｖ邐．邐＞邋ｃｄ逡逑邐邋邐邐邋Ｊｖ．．

Ｆｉｇｕｒｅ邋３．３．邋Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｃｄｃ２５Ｂ邋ｇｅｎｅ邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ逡逑接著，，我們利用ＰＣＲ反應(yīng)克隆獲�。茫洌悖玻担禄騿�(dòng)子片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電逡逑泳檢測發(fā)現(xiàn)在２，０００邋ｂｐ附近可見單一條帶，見圖３．４邋Ａ，這恰好與調(diào)取Ｃｄｃ２５Ｂ基因逡逑啟動(dòng)子片段大小完全相符。將其克隆至雙熒光素酶通用載體ｐＧＬ３－Ｂａｓｉｃ上。酶切驗(yàn)逡逑證可在２，０００邋ｂｐ和５，０００邋ｂｐ附近出現(xiàn)兩條清晰條帶，這與插入的目的片段和線性通逡逑用載體大小完全一致，見圖３．４邋Ｂ。經(jīng)測序比對后，與目的片段的理論序列完全一致，逡逑質(zhì)粒構(gòu)建正確，將其命名為ｐＧＬ３－Ｃｄｃ２５Ｂ＿１９３０。逡逑為進(jìn)一步明確Ｃｄｃ２５Ｂ基因特異調(diào)控的具體區(qū)域，以構(gòu)建成功的逡逑ｐＧＬ３－Ｃｄｃ２５Ｂ＿１９３０質(zhì)粒為模板，利用ＰＣＲ反應(yīng)擴(kuò)增出６條啟動(dòng)子缺失片段，如圖逡逑３．４Ｃ所示。分別將其克隆至雙熒光素酶通用載體ｐＧＬ３－Ｂａｓｉｃ上。酶切驗(yàn)證，如圖逡逑３．４邋Ｄ所示。系列缺失重組質(zhì)粒均可雙酶切得到大小正確的條帶，經(jīng)測序比對與理論逡逑序列完全一致
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R818

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本文編號：2666523