【摘要】：背景:電離輻射(ionizing radiation,IR)引起的DNA損傷是輻射損傷效應(yīng)的重要內(nèi)容之一,也是放射生物學(xué)研究的主要內(nèi)容之一。在輻射引起的DNA損傷修復(fù)過程中ATM/Chk2/p53通路起重要作用。DNA損傷后ATM立刻被激活,活化Chk2,從而磷酸化p53或直接通過p53傳遞損傷信號,開啟DNA損傷修復(fù)進(jìn)程。隨著輻射研究的不斷深入,表觀遺傳學(xué)的逐漸興起,人們發(fā)現(xiàn)組蛋白修飾在DNA損傷修復(fù)中起重要作用。Valérie Borde等研究發(fā)現(xiàn)在IR照射后,SPR-5迅速聚集到DNA雙鏈斷裂(DNA doubled-strand breaks,DSBs)區(qū)移除H3K4me2,從而招募雙鏈斷裂修復(fù)(doubled-strand break repair,DSBR)蛋白對DNA損傷進(jìn)行修復(fù)。Sheema Fnu等發(fā)現(xiàn)H3K36me2在輻射誘導(dǎo)的DSB中可以通過增強(qiáng)非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)介導(dǎo)的DSB損傷修復(fù)。H3K9me3在IR誘導(dǎo)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中會(huì)與Tip60在DNA損傷區(qū)域相互作用,促使ATM激活,進(jìn)而觸發(fā)下游DNA損傷應(yīng)答(DNAdamage response,DDR)對DSB進(jìn)行修復(fù)。目前H3K27me3在DNA損傷修復(fù)中研究較少,Zhiqing Li等人對家蠶在紫外線UV誘導(dǎo)的DNA損傷中發(fā)現(xiàn)PRC2介導(dǎo)的H3K27me3增加,并且發(fā)現(xiàn)具有PcGs基因缺失的蠶細(xì)胞顯示出對UV-C輻射的高度敏感性。同時(shí),Shu-Bin Gao等人研究顯示通過EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑GSK126抑制HepG2細(xì)胞的H3K27me3后會(huì)促進(jìn)化療藥物MMC誘導(dǎo)的DNA損傷。以上研究證實(shí)了組蛋白甲基化在DNA損傷修復(fù)中的重要作用。目的:通過建立干擾EZH2和過表達(dá)HepG2細(xì)胞模型,證實(shí)H3K27me3在輻射誘導(dǎo)DNA損傷中的作用,探討PcGs家族成員EZH2介導(dǎo)的H3K27me3對ATM/Chk2/p53調(diào)控機(jī)制。方法:1.通過流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理組HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期變化。2.通過免疫熒光方法檢測不同處理組HepG2細(xì)胞γH2AX及H3K27me3的表達(dá)。3.通過Real-time PCR方法檢測各處理?xiàng)l件下HepG2細(xì)胞EZH2、BMI1及ATM、Chk2和p53基因表達(dá)水平變化,再通過Western blot方法檢測EZH2、H3K27me3、ATM和p53蛋白表達(dá)水平變化。4.采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法建立干擾EZH2和EZH2過表達(dá)HepG2細(xì)胞模型,觀察EZH2與ATM/Chk2/p53通路的調(diào)控關(guān)系。5.采用免疫共沉淀技術(shù),檢測不同處理組HepG2細(xì)胞ATM啟動(dòng)子區(qū)域H3K27me3的修飾變化。結(jié)果:1.電離輻射對HepG2細(xì)胞周期、DNA損傷及目的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平的影響HepG2細(xì)胞進(jìn)行不同劑量輻射后12h及24h細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯,且呈劑量依賴性升高;各照射組相與假照組比較,γH2AX和H3K27me3焦點(diǎn)數(shù)明顯增多,DNA損傷及H3K27me3表達(dá)呈劑量依賴性升高;輻射組中PcGs家族成員EZH2及BMI-1 mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組,EZH2和H3K27me3蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組;照射后ATM、Chk2及p53基因mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組,同時(shí)ATM、p53蛋白表達(dá)水平亦明顯高于對照組。2.抑制EZH2酶活性后輻射對細(xì)胞周期、DNA損傷及目的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平的影響對HepG2細(xì)胞進(jìn)行不同劑量的照射后,加入3μmol/L GSK126抑制EZH2酶活性,HepG2細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯,呈劑量依賴性升高,而且IR+GSK126組與IR組相比,G2/M期阻滯顯著降低;免疫熒光結(jié)果顯示IR+GSK126組與IR組相比H3K27me3焦點(diǎn)數(shù)明顯減少,而γH2AX焦點(diǎn)數(shù)明顯增多;基因表達(dá)結(jié)果顯示IR+GSK126組與IR組相比EZH2 mRNA表達(dá)水平顯著升高,但H3K27me3蛋白表達(dá)水平卻顯著降低;輻照后6h IR+GSK126組與IR組相比ATM和p53 mRNA表達(dá)水平顯著升高,Chk2 mRNA表達(dá)水平變化不明顯;但輻照后12h在8Gy劑量條件下IR+GSK126組與IR組相比ATM、Chk2及p53mRNA表達(dá)水平顯著降低。3.EZH2干擾和過表達(dá)中輻射對ATM、Chk2及p53基因表達(dá)的影響免疫熒光結(jié)果顯示,干擾EZH2后不同照射劑量組中γH2AX的焦點(diǎn)數(shù)明顯增多,而H3K27me3的焦點(diǎn)數(shù)明顯減少;基因表達(dá)水平結(jié)果顯示EZH2干擾照射組與單純照射組比EZH2 mRNA表達(dá)水平顯著下降,同時(shí)H3K27me3蛋白表達(dá)水平也下降;EZH2過表達(dá)照射組與單純照射組比,EZH2 mRNA和H3K27me3蛋白表達(dá)水平都顯著升高;照射后6h EZH2干擾組與單純照射組比ATM、Chk2、p53 mRNA表達(dá)水平顯著升高;照射后12h EZH2干擾組與單純照射組比ATM、p53蛋白表達(dá)水平明顯升高;EZH2過表達(dá)后ATM、Chk2及p53基因在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平上變化不明顯。4.GSK126處理組和EZH2干擾組中ATM啟動(dòng)子區(qū)域H3K27me3的修飾變化我們在ATM啟動(dòng)子上游-1630~-774區(qū)域及下游719~3475區(qū)分別選取3個(gè)H3K27me3的結(jié)合位點(diǎn),采用ChIP實(shí)驗(yàn)檢測H3K27me3的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)siEZH2組和GSK126組,ATM啟動(dòng)子區(qū)H3K27me3的表達(dá)水平顯著降低。且在PP4位點(diǎn)上H3K27me3的表達(dá)變化最為明顯。結(jié)論:1.在電離輻射誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)中ATM/Chk2/P53通路被激活。2.EZH2甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑GSK126通過降低H3K27me3表達(dá)水平促進(jìn)電離輻射誘導(dǎo)的DNA損傷。3.PcGs家族中關(guān)鍵基因EZH2通過介導(dǎo)ATM啟動(dòng)子區(qū)域的H3K27me3參與到DNA損傷修復(fù)中。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R818

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本文編號：2663143