本文關(guān)鍵詞：乳腺癌及婦科腫瘤組織常染色體SNP突變分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:在法醫(yī)日常司法鑒定實(shí)踐活動(dòng)中,除了常見(jiàn)的血液、血痕、毛發(fā)、唾液等檢材外,還有一類(lèi)特殊的檢材,即腫瘤組織,在某些特定情況下可能成為檢案唯一的參照樣本。與STR相比,SNP具有突變率低和易于檢測(cè)等特點(diǎn),從而對(duì)于腫瘤組織身源認(rèn)定具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。但是目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏對(duì)腫瘤組織SNP穩(wěn)定性的系統(tǒng)研究。本研究旨在探討婦科腫瘤組織和乳腺癌組織的SNP突變規(guī)律,并分析腫瘤類(lèi)型、組織類(lèi)型、分化程度、臨床分期對(duì)SNP突變率的影響,以系統(tǒng)評(píng)估SNP對(duì)該兩種腫瘤組織的法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,并探索應(yīng)對(duì)腫瘤來(lái)源生物學(xué)檢材的高效、準(zhǔn)確的SNP分型方法,以期對(duì)此類(lèi)案件的法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)提供參考。方法:1樣本采集:本實(shí)驗(yàn)中所使用樣本為本科室前期采集的63例乳腺癌和62例婦科惡性腫瘤患者的腫瘤組織和癌旁正常組織,以及10例婦科良性腫瘤組織及正常對(duì)照組織。相應(yīng)地包括患者的年齡、腫瘤類(lèi)型、組織類(lèi)型、臨床分期、分化程度等信息。2 DNA提取:分別用動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒和石蠟包埋組織DNA提取試劑盒提取婦科腫瘤和乳腺癌的腫瘤組織、癌旁正常組織DNA,采用ND-1000蛋白核酸定量?jī)x定量。3 SNP分型:采用SNap Shot multiplex kit試劑盒擴(kuò)增腫瘤組織及正常組織DNA的55個(gè)常染色體SNP基因座;然后進(jìn)行PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化、單堿基延伸反應(yīng)、單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物純化、ABI 3130基因分析儀對(duì)單堿基延伸反應(yīng)純化產(chǎn)物進(jìn)行電泳分型,使用Gene Mapper?v3.2軟件分析結(jié)果,得到腫瘤組織、正常組織的SNP分型。比對(duì)來(lái)自同一個(gè)體的正常組織和腫瘤組織的SNP分型結(jié)果,記錄突變的位點(diǎn)和類(lèi)型。4等位基因特異性PCR擴(kuò)增(AS-PCR)4.1 AS-PCR引物設(shè)計(jì):從55個(gè)SNP位點(diǎn)中選擇18個(gè)基因座,其中9個(gè)為檢測(cè)到突變的基因座,9個(gè)為未檢測(cè)到突變的基因座。根據(jù)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/網(wǎng)站公布的參考序列,結(jié)合引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 6.0和oligo 7.0,以及NCBI blast比對(duì)結(jié)果,對(duì)選取的18個(gè)SNP基因座重新設(shè)計(jì)AS-PCR的兩條等位基因特異性引物和一條通用引物。為增加引物的特異性,在兩條等位基因特異性引物中均額外引入一個(gè)錯(cuò)配堿基;此外,在其中一條等位基因特異性引物5'端加入一段與模板DNA不配對(duì)的核苷酸序列,將SNP序列差異轉(zhuǎn)換為長(zhǎng)度差異,便于后續(xù)毛細(xì)管電泳檢測(cè)。4.2單位點(diǎn)等位基因特異性PCR擴(kuò)增:為驗(yàn)證單位點(diǎn)AS-PCR分型體系的準(zhǔn)確性,選取4例已知SNP分型的健康個(gè)體DNA樣本,分別采用Q5超保真DNA聚合酶和Ampli Taq Gold DNA聚合酶對(duì)其DNA進(jìn)行AS-PCR,產(chǎn)物經(jīng)ABI 3130基因分析儀進(jìn)行檢測(cè),Data Collection V3.0軟件采集數(shù)據(jù),Genemapper V3.2軟件分析數(shù)據(jù)得到SNP分型。5 SNP突變驗(yàn)證:采取多次重復(fù)SNap Shot實(shí)驗(yàn)、單等位基因Sanger測(cè)序、單位點(diǎn)AS-PCR對(duì)部分突變位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:應(yīng)用Excel、SPSS v21.0軟件對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,用χ~2檢驗(yàn)分別比較婦科腫瘤和乳腺癌不同腫瘤類(lèi)型、組織類(lèi)型、分化程度的SNP突變差異;用秩和檢驗(yàn)分別比較兩種腫瘤不同臨床分期的SNP突變差異;用χ~2檢驗(yàn)比較婦科腫瘤與乳腺癌組織之間SNP突變率的差異。結(jié)果:1 AS-PCR體系構(gòu)建及準(zhǔn)確性驗(yàn)證設(shè)計(jì)了18個(gè)SNPs位點(diǎn)的AS-PCR引物,引物長(zhǎng)度18~32個(gè)堿基,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度107~217bp。見(jiàn)Table1。4例已知SNP分型的DNA樣本經(jīng)AS-PCR,結(jié)果顯示Q5超保真DNA聚合酶得到的SNP分型存在非特異性擴(kuò)增,與已知分型均不一致;而Ampli Taq Gold DNA聚合酶得到的SNP分型結(jié)果與已知分型完全一致,結(jié)果正確。選取六個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因進(jìn)行Sanger測(cè)序,其中rs1109037、rs740598、rs10092491測(cè)序失敗,其余三個(gè)位點(diǎn)rs2342747、rs6444724、rs159606的等位基因序列與NCBI網(wǎng)站提供的標(biāo)準(zhǔn)序列一致,驗(yàn)證了所構(gòu)建的AS-PCR分型體系的準(zhǔn)確性。2婦科腫瘤組織的SNP突變10例婦科良性腫瘤組織未檢出突變;62例婦科惡性腫瘤組織經(jīng)SNap Shot方法分型后,共發(fā)現(xiàn)5例樣本的五個(gè)SNP位點(diǎn)發(fā)生了突變,突變類(lèi)型表現(xiàn)為雜合性丟失,包括9號(hào)樣本和29號(hào)樣本的rs13218440、16號(hào)樣本的rs1523537、18號(hào)樣本的rs1498553和28號(hào)樣本的rs315791。選取9號(hào)、18號(hào)、29號(hào)樣本進(jìn)行AS-PCR,并對(duì)9號(hào)、18號(hào)、28號(hào)、29號(hào)腫瘤組織DNA進(jìn)行Sanger測(cè)序。16號(hào)樣本的rs1523537位點(diǎn)三次SNap Shot分型結(jié)果一致,故未采用其它方法進(jìn)行驗(yàn)證。綜合上述三種方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定有3例(9號(hào)、16號(hào)、28號(hào))婦科腫瘤組織共3個(gè)SNP(rs13218440、rs1523537、rs315791)存在突變,突變類(lèi)型均為等位基因雜合性丟失。比較良、惡性婦科腫瘤組織SNP突變率,其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)過(guò)χ~2檢驗(yàn)分別比較婦科三種不同腫瘤類(lèi)型、組織類(lèi)型、分化程度的SNP突變率,均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示,婦科腫瘤組織不同臨床分期的SNP突變率亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。比較婦科腫瘤組織SNP與本實(shí)驗(yàn)室前期STR檢測(cè)結(jié)果,在樣本及基因座水平SNP突變率均顯著低于STR突變率(P0.05)。3乳腺癌的SNP突變63例乳腺癌樣本經(jīng)SNap Shot方法分型后,共三對(duì)樣本26個(gè)SNP位點(diǎn)發(fā)生了突變,包括2號(hào)的rs445251、40號(hào)的rs2270529和7號(hào)的24個(gè)SNP位點(diǎn)。選取了7號(hào)樣本的15個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序,以及7個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行AS-PCR驗(yàn)證。綜合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定上述3例乳腺癌樣本共21個(gè)SNP位點(diǎn)存在突變,其中15個(gè)SNP位點(diǎn)突變類(lèi)型為等位基因雜合性丟失,2個(gè)為純合子突變?yōu)殡s合子(rs1478829:T→T/A,rs1821380:C→G/C),3個(gè)為SNP位點(diǎn)轉(zhuǎn)換(rs8078417:A→G,rs338882:C→T,rs1027895:C→T),1個(gè)為SNP位點(diǎn)顛換(rs10776839:A→C)。經(jīng)秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示,乳腺腫瘤組織不同臨床分期的SNP突變率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)χ~2檢驗(yàn)結(jié)果顯示,中高分化和低分化乳腺癌組織的個(gè)體SNP突變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。比較乳腺癌SNP與本實(shí)驗(yàn)室前期STR檢測(cè)結(jié)果,在樣本及基因座水平SNP突變率均顯著低于STR突變率(P0.05)。4婦科與乳腺腫瘤的SNP突變比較:經(jīng)χ~2檢驗(yàn),婦科腫瘤組織與乳腺癌在個(gè)體水平SNP突變率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而乳腺癌的SNP突變位點(diǎn)數(shù)顯著多于婦科腫瘤組織(P0.05)。結(jié)論:1在乳腺癌和婦科腫瘤組織SNP突變率低于STR,有望篩選到穩(wěn)定的SNP體系應(yīng)用于腫瘤組織身源鑒定。2 AS-PCR對(duì)腫瘤組織SNP分型準(zhǔn)確、方法簡(jiǎn)便,為法醫(yī)物證檢驗(yàn)提供一種有效的檢測(cè)方法。
【關(guān)鍵詞】：單核苷酸多態(tài)性 婦科腫瘤 乳腺癌 突變 等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：D919
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫(xiě)13-14
• 前言14-16
• 材料與方法16-31
• 結(jié)果31-35
• 附圖35-53
• 附表53-64
• 討論64-70
• 結(jié)論70-71
• 參考文獻(xiàn)71-74
• 綜述 腫瘤組織SNP的檢測(cè)及相關(guān)方法74-85
• 參考文獻(xiàn)81-85
• 致謝85-86
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷86

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本文編號(hào)：265042