本文關(guān)鍵詞：乳腺癌及婦科腫瘤組織常染色體SNP突變分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:在法醫(yī)日常司法鑒定實踐活動中,除了常見的血液、血痕、毛發(fā)、唾液等檢材外,還有一類特殊的檢材,即腫瘤組織,在某些特定情況下可能成為檢案唯一的參照樣本。與STR相比,SNP具有突變率低和易于檢測等特點,從而對于腫瘤組織身源認定具有潛在的應(yīng)用價值。但是目前國內(nèi)外尚缺乏對腫瘤組織SNP穩(wěn)定性的系統(tǒng)研究。本研究旨在探討婦科腫瘤組織和乳腺癌組織的SNP突變規(guī)律,并分析腫瘤類型、組織類型、分化程度、臨床分期對SNP突變率的影響,以系統(tǒng)評估SNP對該兩種腫瘤組織的法醫(yī)學檢驗的實際應(yīng)用價值,并探索應(yīng)對腫瘤來源生物學檢材的高效、準確的SNP分型方法,以期對此類案件的法醫(yī)學檢驗提供參考。方法:1樣本采集:本實驗中所使用樣本為本科室前期采集的63例乳腺癌和62例婦科惡性腫瘤患者的腫瘤組織和癌旁正常組織,以及10例婦科良性腫瘤組織及正常對照組織。相應(yīng)地包括患者的年齡、腫瘤類型、組織類型、臨床分期、分化程度等信息。2 DNA提取:分別用動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒和石蠟包埋組織DNA提取試劑盒提取婦科腫瘤和乳腺癌的腫瘤組織、癌旁正常組織DNA,采用ND-1000蛋白核酸定量儀定量。3 SNP分型:采用SNap Shot multiplex kit試劑盒擴增腫瘤組織及正常組織DNA的55個常染色體SNP基因座;然后進行PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化、單堿基延伸反應(yīng)、單堿基延伸反應(yīng)產(chǎn)物純化、ABI 3130基因分析儀對單堿基延伸反應(yīng)純化產(chǎn)物進行電泳分型,使用Gene Mapper?v3.2軟件分析結(jié)果,得到腫瘤組織、正常組織的SNP分型。比對來自同一個體的正常組織和腫瘤組織的SNP分型結(jié)果,記錄突變的位點和類型。4等位基因特異性PCR擴增(AS-PCR)4.1 AS-PCR引物設(shè)計:從55個SNP位點中選擇18個基因座,其中9個為檢測到突變的基因座,9個為未檢測到突變的基因座。根據(jù)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/網(wǎng)站公布的參考序列,結(jié)合引物設(shè)計軟件Primer Premier 6.0和oligo 7.0,以及NCBI blast比對結(jié)果,對選取的18個SNP基因座重新設(shè)計AS-PCR的兩條等位基因特異性引物和一條通用引物。為增加引物的特異性,在兩條等位基因特異性引物中均額外引入一個錯配堿基;此外,在其中一條等位基因特異性引物5'端加入一段與模板DNA不配對的核苷酸序列,將SNP序列差異轉(zhuǎn)換為長度差異,便于后續(xù)毛細管電泳檢測。4.2單位點等位基因特異性PCR擴增:為驗證單位點AS-PCR分型體系的準確性,選取4例已知SNP分型的健康個體DNA樣本,分別采用Q5超保真DNA聚合酶和Ampli Taq Gold DNA聚合酶對其DNA進行AS-PCR,產(chǎn)物經(jīng)ABI 3130基因分析儀進行檢測,Data Collection V3.0軟件采集數(shù)據(jù),Genemapper V3.2軟件分析數(shù)據(jù)得到SNP分型。5 SNP突變驗證:采取多次重復(fù)SNap Shot實驗、單等位基因Sanger測序、單位點AS-PCR對部分突變位點進行驗證。6統(tǒng)計學分析:應(yīng)用Excel、SPSS v21.0軟件對上述實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析,用χ~2檢驗分別比較婦科腫瘤和乳腺癌不同腫瘤類型、組織類型、分化程度的SNP突變差異;用秩和檢驗分別比較兩種腫瘤不同臨床分期的SNP突變差異;用χ~2檢驗比較婦科腫瘤與乳腺癌組織之間SNP突變率的差異。結(jié)果:1 AS-PCR體系構(gòu)建及準確性驗證設(shè)計了18個SNPs位點的AS-PCR引物,引物長度18~32個堿基,擴增產(chǎn)物長度107~217bp。見Table1。4例已知SNP分型的DNA樣本經(jīng)AS-PCR,結(jié)果顯示Q5超保真DNA聚合酶得到的SNP分型存在非特異性擴增,與已知分型均不一致;而Ampli Taq Gold DNA聚合酶得到的SNP分型結(jié)果與已知分型完全一致,結(jié)果正確。選取六個SNP位點的等位基因進行Sanger測序,其中rs1109037、rs740598、rs10092491測序失敗,其余三個位點rs2342747、rs6444724、rs159606的等位基因序列與NCBI網(wǎng)站提供的標準序列一致,驗證了所構(gòu)建的AS-PCR分型體系的準確性。2婦科腫瘤組織的SNP突變10例婦科良性腫瘤組織未檢出突變;62例婦科惡性腫瘤組織經(jīng)SNap Shot方法分型后,共發(fā)現(xiàn)5例樣本的五個SNP位點發(fā)生了突變,突變類型表現(xiàn)為雜合性丟失,包括9號樣本和29號樣本的rs13218440、16號樣本的rs1523537、18號樣本的rs1498553和28號樣本的rs315791。選取9號、18號、29號樣本進行AS-PCR,并對9號、18號、28號、29號腫瘤組織DNA進行Sanger測序。16號樣本的rs1523537位點三次SNap Shot分型結(jié)果一致,故未采用其它方法進行驗證。綜合上述三種方法的實驗結(jié)果,確定有3例(9號、16號、28號)婦科腫瘤組織共3個SNP(rs13218440、rs1523537、rs315791)存在突變,突變類型均為等位基因雜合性丟失。比較良、惡性婦科腫瘤組織SNP突變率,其差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。經(jīng)過χ~2檢驗分別比較婦科三種不同腫瘤類型、組織類型、分化程度的SNP突變率,均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學差異。經(jīng)秩和檢驗結(jié)果顯示,婦科腫瘤組織不同臨床分期的SNP突變率亦無統(tǒng)計學差異。比較婦科腫瘤組織SNP與本實驗室前期STR檢測結(jié)果,在樣本及基因座水平SNP突變率均顯著低于STR突變率(P0.05)。3乳腺癌的SNP突變63例乳腺癌樣本經(jīng)SNap Shot方法分型后,共三對樣本26個SNP位點發(fā)生了突變,包括2號的rs445251、40號的rs2270529和7號的24個SNP位點。選取了7號樣本的15個SNP位點進行Sanger測序,以及7個SNP位點進行AS-PCR驗證。綜合分析實驗結(jié)果,確定上述3例乳腺癌樣本共21個SNP位點存在突變,其中15個SNP位點突變類型為等位基因雜合性丟失,2個為純合子突變?yōu)殡s合子(rs1478829:T→T/A,rs1821380:C→G/C),3個為SNP位點轉(zhuǎn)換(rs8078417:A→G,rs338882:C→T,rs1027895:C→T),1個為SNP位點顛換(rs10776839:A→C)。經(jīng)秩和檢驗結(jié)果顯示,乳腺腫瘤組織不同臨床分期的SNP突變率無統(tǒng)計學差異。經(jīng)χ~2檢驗結(jié)果顯示,中高分化和低分化乳腺癌組織的個體SNP突變無統(tǒng)計學差異。比較乳腺癌SNP與本實驗室前期STR檢測結(jié)果,在樣本及基因座水平SNP突變率均顯著低于STR突變率(P0.05)。4婦科與乳腺腫瘤的SNP突變比較:經(jīng)χ~2檢驗,婦科腫瘤組織與乳腺癌在個體水平SNP突變率無統(tǒng)計學差異,而乳腺癌的SNP突變位點數(shù)顯著多于婦科腫瘤組織(P0.05)。結(jié)論:1在乳腺癌和婦科腫瘤組織SNP突變率低于STR,有望篩選到穩(wěn)定的SNP體系應(yīng)用于腫瘤組織身源鑒定。2 AS-PCR對腫瘤組織SNP分型準確、方法簡便,為法醫(yī)物證檢驗提供一種有效的檢測方法。
【關(guān)鍵詞】：單核苷酸多態(tài)性 婦科腫瘤 乳腺癌 突變 等位基因特異性聚合酶鏈反應(yīng)
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：D919
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-16
• 材料與方法16-31
• 結(jié)果31-35
• 附圖35-53
• 附表53-64
• 討論64-70
• 結(jié)論70-71
• 參考文獻71-74
• 綜述 腫瘤組織SNP的檢測及相關(guān)方法74-85
• 參考文獻81-85
• 致謝85-86
• 個人簡歷86

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1 劉玉萍,郭道謙,李沐;利用S狀鉤協(xié)助取出婦科腫瘤——附25例分析[J];中國婦幼保健;2000年08期

2 蒙麗珍;婦科腫瘤無警惕 遠處轉(zhuǎn)移方察知——2例婦科腫瘤誤診的教訓[J];新醫(yī)學;2002年01期

3 沈鏗,郎景和;二十一世紀的婦科腫瘤[J];中國醫(yī)學科學院學報;2003年04期

4 ;婦科腫瘤臨床診治與研究進展學習班通知[J];中華腫瘤雜志;2004年06期

5 唐步堅;婦科腫瘤科學進展[J];廣西醫(yī)學;2004年10期

6 豐有吉,張惜陰;我國婦科腫瘤臨床治療的進展[J];上海醫(yī)學;2004年09期

7 豐有吉,張惜陰;我國婦科腫瘤臨床治療的進展[J];繼續(xù)醫(yī)學教育;2005年05期

8 張燕;李成建;鄭剛;;我國婦科腫瘤主要期刊初步調(diào)查[J];現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展;2007年01期

9 廖治;李莉;肖洪濤;高雪梅;;組蛋白去乙�；讣捌湟种苿┡c婦科腫瘤[J];四川腫瘤防治;2007年03期

10 ;2008年國際婦科腫瘤論壇(中國·無錫)第一輪通知[J];中國實用婦科與產(chǎn)科雜志;2008年05期

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1 曹澤毅;;我國婦科腫瘤研究發(fā)展現(xiàn)況[A];紀念卓越的人民醫(yī)學家林巧稚大夫誕辰100周年——全國婦產(chǎn)科高級學術(shù)論壇論文集[C];2001年

2 孔為民;孫建衡;;重視婦科腫瘤規(guī)范化治療 提高婦科腫瘤治療水平——124例病例分析[A];中國抗癌協(xié)會婦科腫瘤專業(yè)委員會第六次全國學術(shù)會議論文匯編[C];2001年

3 陳樂真;;婦科腫瘤發(fā)展的基礎(chǔ)[A];第八次全國婦產(chǎn)科學學術(shù)會議論文匯編[C];2004年

4 曹澤毅;;中國大陸婦科腫瘤醫(yī)生的培訓[A];中華醫(yī)學會全國婦科腫瘤醫(yī)生培訓研討會講義[C];2006年

5 曹澤毅;;手術(shù)治療在婦科腫瘤中的作用[A];中華醫(yī)學會全國婦科腫瘤醫(yī)生培訓研討會講義[C];2006年

6 沈鏗;;婦科腫瘤的人性化治療[A];中華醫(yī)學會第一屆全球華人婦產(chǎn)科學術(shù)大會暨第三次全國婦產(chǎn)科中青年醫(yī)師學術(shù)會議論文匯編[C];2007年

7 沈鏗;;婦科腫瘤的人性化治療[A];2011中國婦產(chǎn)科學術(shù)會議暨浙江省計劃生育與生殖醫(yī)學學術(shù)年會暨生殖健康講習班論文匯編[C];2011年

8 ;婦科腫瘤疑難病例討論會及婦科微創(chuàng)技術(shù)研討會會議流程[A];婦科腫瘤疑難病例討論會暨婦科微創(chuàng)技術(shù)研討會會議資料匯編[C];2012年

9 張全玲;;妊娠并存婦科腫瘤的診斷與處理[A];紀念卓越的人民醫(yī)學家林巧稚大夫誕辰100周年——全國婦產(chǎn)科高級學術(shù)論壇論文集[C];2001年

10 沈鏗;;繼往開來,為了中國婦科腫瘤的明天——第七屆中國婦科腫瘤學組(CGOG)工作總結(jié)及展望[A];第八次全國婦產(chǎn)科學學術(shù)會議論文匯編[C];2004年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳明清;國內(nèi)具有婦科腫瘤醫(yī)生資質(zhì)者不足千人[N];中國醫(yī)藥報;2007年

2 雍偉哲;永遠的追求[N];大眾科技報;2006年

3 何蓉;中華婦科腫瘤疑難會診中心成立[N];大眾科技報;2007年

4 李穎;打造世界一流醫(yī)療學術(shù)機構(gòu)[N];科技日報;2007年

5 記者 顧泳;婦科腫瘤有新檢測方法[N];解放日報;2013年

6 澤雯;姚書忠教授：婦科腫瘤微創(chuàng)治療更趨人性化[N];中國醫(yī)藥報;2013年

7 記者 楊彤邋通訊員 劉青松;專科專病專治：婦科腫瘤必須實行規(guī)范化診治[N];泰州日報;2008年

8 袁琳;婦科腫瘤自查四法[N];大眾衛(wèi)生報;2009年

9 記者 尹慧文 通訊員 彭萍;婦科腫瘤治療有望進入“靶向時代”[N];大眾衛(wèi)生報;2014年

10 錢進;自查發(fā)現(xiàn)婦科腫瘤[N];中國中醫(yī)藥報;2007年

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1 李紅霞;婦科腫瘤組織及血漿中mtDNA突變與細胞凋亡基因表達的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2002年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 白梅;乳腺癌及婦科腫瘤組織常染色體SNP突變分析[D];河北醫(yī)科大學;2016年

2 陸俊;尿液熒光光譜技術(shù)在婦科腫瘤診斷中的應(yīng)用研究[D];江南大學;2009年

3 馮飛;婦科腫瘤中醫(yī)古文獻整理及特色療法挖掘研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2013年

4 倪千喜;婦科腫瘤后裝逆向調(diào)強放射治療的劑量學研究[D];清華大學;2013年

5 張繼;基于數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的婦科腫瘤病人住院費用研究[D];鄭州大學;2011年

6 何建川;傅里葉變換紅外光譜應(yīng)用于經(jīng)染色處理的婦科腫瘤組織切片的研究[D];重慶大學;2005年

7 楊安娜;21個單核苷酸多態(tài)性位點與婦科腫瘤相關(guān)性的遺傳學研究[D];大連醫(yī)科大學;2010年

8 司亞茹;旋復(fù)花（Inula britanica L.）中抑制婦科腫瘤細胞增殖活性化合物的篩選及其作用機制的研究[D];河北醫(yī)科大學;2009年

9 肖超強;常見婦科腫瘤血清中糖蛋白標志物的篩選分析[D];安徽醫(yī)科大學;2014年

10 孫麗娟;常染色體及X染色體STR在乳腺癌及婦科腫瘤組織中的變異分析[D];河北醫(yī)科大學;2014年

  本文關(guān)鍵詞：乳腺癌及婦科腫瘤組織常染色體SNP突變分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：265042