發(fā)布時間：2020-02-15 13:26

【摘要】：隨著日常生活中通訊、網(wǎng)絡(luò)、醫(yī)療器械等設(shè)備的應(yīng)用，輻射與我們的生活越來越密切。但是輻射在給人類帶來便利的同時，也嚴(yán)重影響著人們的身體健康，因而受到人們的廣泛關(guān)注。既往研究顯示，大鼠在受到輻射作用后，會出現(xiàn)心電圖、血壓等改變，而這些改變與心肌閏盤（Intercalated Discs，ID）有著極其密切的關(guān)系，但具體的機(jī)制尚不清楚。本研究以SD大鼠和H9c2（2-1）心肌細(xì)胞株為研究對象，應(yīng)用電鏡、免疫組化、蛋白免疫印跡雜交、Real Time-PCR等實驗方法，明確EMP和X射線輻照對大鼠心肌閏盤結(jié)構(gòu)及其連接蛋白的影響及變化規(guī)律，并初步探明EMP和X射線輻照誘導(dǎo)心肌閏盤結(jié)構(gòu)損傷的可能分子機(jī)制。 目的： 研究EMP及X線輻照對大鼠心肌閏盤結(jié)構(gòu)及縫隙連接蛋白的影響及可能機(jī)制。 方法： 采用EMP和X射線分別照射SD大鼠。EMP輻照參數(shù)：場強(qiáng)為200kV/m，前沿15ns，脈寬10ns，脈沖次數(shù)200次，脈沖間隔為7s；X射線輻照劑量為20Gy。EMP輻照后0h、1h、3h、6h、12h和24h后，X射線輻照后1h、3h、6h、12h和24h后，分別麻醉條件下處死大鼠，取左心室肌，進(jìn)行下一步實驗檢測。 1.用硝酸鑭示蹤法在電鏡下觀察心肌細(xì)胞和閏盤形態(tài)學(xué)的改變。 2.用Western Blot方法檢測心肌閏盤縫隙連接蛋白Cx43，p-Cx43，Cx40及Cx45的含量變化。 3.用Real Time-PCR檢測左心室肌的Cx43、Cx40及Cx45的mRNA表達(dá)水平及調(diào)控Cx43的miR-1表達(dá)水平的變化。 4.用20Gy（MTT法確定）的X射線照射H9c2（2-1）心肌細(xì)胞株，在照后1h、3h、6h、12h、24h收集細(xì)胞，用Western blot方法檢測連接蛋白Cx43、p-Cx43的含量變化以及MAPK通路中p38、p-p38、ERK和p-ERK蛋白表達(dá)的改變，用RealTime-PCR檢測Cx43mRNA水平和miR-1含量的變化。 結(jié)果： 1. EMP、X射線輻照SD大鼠，電鏡下觀察心肌閏盤結(jié)構(gòu)異常，均呈閏盤間隙增寬且在1h~6h內(nèi)隨時間延長其損傷加重，12h后逐漸恢復(fù)，呈可逆性改變特征。 2. EMP、X射線輻照SD大鼠后，Cx43蛋白及其磷酸化水平均明顯增高，而Cx40、Cx45蛋白變化不大。 3. EMP、X射線輻照射SD大鼠后，Cx43mRNA水平升高，而Cx40、Cx45的mRNA水平變化不顯著；對Cx43基因具有調(diào)控作用的miR-1含量明顯降低。 4. X射線20Gy照射大鼠心肌細(xì)胞H9c2（2-1）后，其Cx43和p-Cx43的蛋白表達(dá)水平降低，MAPK相關(guān)蛋白p38，p-p38，ERK和p-ERK的蛋白表達(dá)水平也均降低。而Cx43的mRNA水平略有升高， miR-1水平僅有降低趨勢。。 結(jié)論： EMP及X射線均可作用于心肌閏盤，使閏盤間隙顯著增寬，發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，損傷心肌細(xì)胞，并導(dǎo)致閏盤連接蛋白Cx43mRNA和蛋白及其磷酸化水平均明顯增高，miR-1表達(dá)降低，miR-1可能參與了對Cx43基因的調(diào)控。EMP、X射線對心肌閏盤損傷的作用機(jī)制可能是射線作用于心肌閏盤結(jié)構(gòu)，致使其連接子聯(lián)接破壞，閏盤連接中最敏感的縫隙連接分離，使得其間隙增寬擴(kuò)大，組成縫隙連接的主成份是Cx43蛋白，此時急需新Cx43更新補(bǔ)充，并修復(fù)受損的連接子，為此激活了Cx43基因高表達(dá)，加速Cx43磷酸化過程；另一途徑通過miR-1對靶基因Cx43進(jìn)行調(diào)控作用，miR-1降表達(dá)以促進(jìn)Cx43的表達(dá)，，共同加快修復(fù)閏盤結(jié)構(gòu)的損傷。
【圖文】：

閏盤是心肌細(xì)胞膜的特化結(jié)構(gòu)，心肌細(xì)胞間通過閏盤互相連接，使心室肌形成一個整體。閏盤是心肌細(xì)胞間機(jī)械連接與心電傳導(dǎo)的結(jié)構(gòu)單位。閏盤由心肌細(xì)胞間三種特殊的連接構(gòu)成，分別是橋粒、中間連接和縫隙連接（如圖1）。

圖 2 縫隙連接及連接蛋白結(jié)構(gòu)示意圖2.4 連接蛋白43與MAPK信號調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（signal transduction pathway）：在細(xì)胞中各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子相互識別、相互作用，將信號進(jìn)行轉(zhuǎn)換和傳遞，構(gòu)成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。當(dāng)外界環(huán)境變化時，單細(xì)胞生物可以直接做出反應(yīng)，多細(xì)胞生物則通過復(fù)雜的信號傳遞系統(tǒng)來傳遞信息，從而調(diào)控機(jī)體活動。傳導(dǎo)方式包括相鄰細(xì)胞直接接觸、細(xì)胞分泌各種化學(xué)物質(zhì)來調(diào)節(jié)其它細(xì)胞代謝和功能。跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一般步驟包括：特定的細(xì)胞釋放信息物質(zhì)，細(xì)胞物質(zhì)經(jīng)擴(kuò)散或血循環(huán)到達(dá)靶細(xì)胞，與靶細(xì)胞受體特異性的結(jié)合，受體對信號進(jìn)行轉(zhuǎn)換并啟動細(xì)胞內(nèi)信使系統(tǒng)，靶細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。目前發(fā)現(xiàn)有多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以調(diào)節(jié)連接蛋白Cx43，能夠使Cx43磷酸化，Cx43羧基末端的2個酪氨酸和21個絲氨酸中的12個位點可以被磷酸化[22]，其中絲裂原
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R818.74

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本文編號：2579822