【摘要】：電離輻射是能誘發(fā)生物效應(yīng)、對(duì)人類健康產(chǎn)生影響的天然和人為環(huán)境主要物理因素之一。另外,作為醫(yī)學(xué)診斷和放射治療的重要技術(shù)手段,輻射在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用在不斷擴(kuò)大。然而,無(wú)論是對(duì)接受放射治療的患者還是提供放射治療的醫(yī)師,正確認(rèn)識(shí)和有效的避免輻射帶來(lái)的損傷都是十分重要的。因此,研究減少輻射對(duì)正常組織產(chǎn)生的旁觀者效應(yīng)甚至遠(yuǎn)期損傷效應(yīng)都具有重要的意義,這也是放射生物學(xué)和放射治療學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注的長(zhǎng)期任務(wù)。早在1992年,科學(xué)家已經(jīng)證實(shí)電離輻射誘導(dǎo)的損傷不僅發(fā)生于直接受照的細(xì)胞,而且在其周圍的未受照細(xì)胞也發(fā)生一系列的損傷性改變,稱之為輻射旁效應(yīng),輻射誘導(dǎo)的旁效應(yīng)給周圍正常細(xì)胞和組織造成嚴(yán)重的危害。近年來(lái)的一些研究發(fā)現(xiàn),輻照細(xì)胞產(chǎn)生的一些細(xì)胞因子和活性氧等小分子物質(zhì)參與輻射旁效應(yīng),而輻射誘導(dǎo)miRNA的改變以及產(chǎn)生的旁效應(yīng)也陸續(xù)被報(bào)道,為了進(jìn)一步研究來(lái)自受照細(xì)胞的外泌體(exosome) miRNA在旁效應(yīng)中的作用,本研究以人正常支氣管上皮細(xì)胞BEP2D作為研究對(duì)象,利用輻照處理細(xì)胞后,收集照射后的細(xì)胞培養(yǎng)基分離其中的外泌體,提取外泌體RNA并通過(guò)miRNA芯片技術(shù)分析外泌體中miRNA的表達(dá)譜變化,篩選出對(duì)輻射響應(yīng)較為明顯的miRNA并且進(jìn)一步驗(yàn)證,然后,對(duì)這些輻射誘導(dǎo)的外泌體miRNA在旁效應(yīng)中的作用及機(jī)制展開了深入研究。目的：鑒定來(lái)源于輻照細(xì)胞的外泌體中miRNA表達(dá)譜,獲得輻射誘導(dǎo)表達(dá)的外泌體miRNA信息,研究其中部分：miRNA (miR-7-5p和miR-1246)對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D產(chǎn)生的旁效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制。方法：利用梯度超速離心法從培養(yǎng)液收集細(xì)胞分泌的外泌體；在透射電鏡下觀察并鑒定細(xì)胞分泌的外泌體形態(tài)；提取來(lái)源于照射和對(duì)照細(xì)胞外泌體中的RNA做miRNA芯片鑒定,選擇外泌體中受輻射影響較明顯的miR-7-5p和miR-1246作為研究對(duì)象,做進(jìn)一步的效應(yīng)研究；通過(guò)RT-qPCR技術(shù)驗(yàn)證miRNA分子的差異表達(dá)變化；通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性變化；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的變化；利用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察外泌體在人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D中的攝入和miR-7-5p對(duì)細(xì)胞自噬泡產(chǎn)生的影響；通過(guò)western blot方法檢自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin1、p62以及自噬相關(guān)信號(hào)通路調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)變化；通過(guò)免疫熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)BEP2D細(xì)胞中DNA損傷相關(guān)蛋白53BP1的foci形成、以及微核檢測(cè)實(shí)驗(yàn)來(lái)分析DNA損傷情況。結(jié)果：(1)正常的人支氣管上皮細(xì)胞照射后的外泌體中miRNA的表達(dá)譜發(fā)生明顯的變化,在照射后4hr外泌體中有6個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào),6個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào),照射后8hr外泌體中則有4個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào),7個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào),其中miR-7-5p和miR-1246在照射后4hr和8hr出現(xiàn)表達(dá)持續(xù)上調(diào),而細(xì)胞內(nèi)的miR-7-5p以及miR-1246在照射后4hr的表達(dá)明顯降低(p0.01)；(2)增力miR-7-5p表達(dá)明顯抑制細(xì)胞的增殖,細(xì)胞的自噬顯著(p0.05),表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)自噬泡增多、自噬相關(guān)蛋白LC3B和Beclinl的表達(dá)明顯增加,p62的降解也增加。增加miR-7-5p表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期無(wú)明顯作用(p0.05)；(3)細(xì)胞分泌的外泌體能夠被未照射的人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D有效攝入,而且在未照射的人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D中檢測(cè)到miR-7-5p的表達(dá)明顯增加(p0.05)；(4)含miR-7-5p的外泌體處理未照射的人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D后,也導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制和自噬增加,miR-7-5p抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)或減弱上述作用；(5)miR-7-5p誘導(dǎo)細(xì)胞自噬主要通過(guò)抑制靶基因EGFR的作用,對(duì)自噬相關(guān)信號(hào)通路中的AKT和mTOR的磷酸化也有明顯的抑制作用,miR-7-5p抑制劑處理后抑制作用消失,外泌體miR-7-5p有同樣的作用；(6)2Gy照射人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D后4hr收集的條件培養(yǎng)液能導(dǎo)致細(xì)胞的微核數(shù)目明顯增加(p0.05),DNA損傷相關(guān)蛋白53BP1的聚焦點(diǎn)(1oci)形成增多(p0.05),即顯示出基因組DNA損傷效應(yīng)；(7)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)增加外泌體miR-1246表達(dá)能誘導(dǎo)不同的未照射細(xì)胞產(chǎn)生微核(p0.05),促進(jìn)DNA損傷相關(guān)蛋白53BP1聚焦點(diǎn)(foci)形成(p0.05)。結(jié)論本課題主要以正常的人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D作為研究對(duì)象,鑒定了輻射誘導(dǎo)表達(dá)增加的外泌體miRNA分子,探討了其生物學(xué)效應(yīng),研究結(jié)論總結(jié)如下：1：輻射誘導(dǎo)正常的人支氣管上皮細(xì)胞BEP2D分泌外泌體到細(xì)胞外微環(huán)境中,照射后的外泌體miRNA表達(dá)譜發(fā)生明顯的改變；2：照射后的外泌體中miR-7-5p和miR-1246在照后的一段時(shí)間內(nèi)都出現(xiàn)表達(dá)持續(xù)上調(diào)的現(xiàn)象,而此時(shí)的細(xì)胞內(nèi)則出現(xiàn)miRNA表達(dá)降低；3：輻射誘導(dǎo)的外泌體miR-7-5p通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬而抑制細(xì)胞增殖,其作用機(jī)制主要是通過(guò)對(duì)靶基因EGFR的調(diào)控下,影響了其下游的自噬相關(guān)通路AKT/mTOR,通過(guò)EGFR/AKT/mTOR軸調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬；4：輻射誘導(dǎo)的外泌體miR-1246通過(guò)條件培養(yǎng)基的介導(dǎo),促進(jìn)未照射細(xì)胞微核的產(chǎn)生和DNA損傷相關(guān)蛋白53BP1聚焦點(diǎn)(foci)的形成,產(chǎn)生旁基因組損傷效應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R818

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本文編號(hào)：2474471