【摘要】：目的： 研究放射性核素標(biāo)記NGR的生物活性，通過體外篩選確定CD13表達(dá)陽性細(xì)胞株，建立腫瘤動物研究模型，探索核素標(biāo)記NGR對腫瘤顯像的可行性，比較NGR單體與二聚體的體內(nèi)生物學(xué)分布及對腫瘤顯像的差異，建立腫瘤新生血管核素靶向顯像新方法。 方法： Iodogen法合成~(131)I-NGR，直接標(biāo)記法合成~(99)mTc-NGR，TLC法測定產(chǎn)物標(biāo)記率并評價(jià)其放射化學(xué)性質(zhì)。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)分別檢測HT-1080、HUVEC、HepG2、U87Mg、PC-3、HT-29和MCF-7細(xì)胞株的CD13表達(dá)，對強(qiáng)陽性表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行~(131)I-NGR體外受體分析。MTT法測定不同濃度Na~(131)I、NGR和~(131)I-NGR在24、48和72h對CD13陽性和陰性細(xì)胞株的體外細(xì)胞生長抑制率。選取CD13高表達(dá)的HepG2細(xì)胞建立肝癌荷瘤裸鼠模型，尾靜脈注射7.4MBq (0.2mL)~(99)mTc-NGR，競爭性抑制組注射~(99)mTc-NGR前0.5h額外注射未標(biāo)記NGR100μg（50μL）。分別于注射后1、2、4、8、12h測量各臟器放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算組織百分注射劑量率(％ID/g)，計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤(T)與非靶組織(NT)的放射性計(jì)數(shù)比。同期進(jìn)行SPECT顯像，并采用ROI法同步測定T/NT隨時(shí)間的動態(tài)變化趨勢。為進(jìn)一步比較NGR單體與二聚體的差異，即比較~(99)mTc-NGR1和~(99)mTc-NGR2與HepG2細(xì)胞的體外結(jié)合力及其在HepG2肝癌細(xì)胞小鼠腫瘤模型的生物分布，注射7.4MBq~(99)mTc-NGR1和~(99)mTc-NGR2后分別于1,4,12和24h進(jìn)行SPECT顯像，另外對于~(99)mTc-NGR2，預(yù)先注射未標(biāo)記NGR2肽(20mg/kg)后進(jìn)行顯像觀察探針的體內(nèi)特異性。計(jì)量資料用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 成功標(biāo)記~(131)I-NGR，，最佳標(biāo)記條件為Na~(131)I18.5MBq、NGR肽10μg和Iodogen20μg，標(biāo)記率為(93.7±2.5)%，比活度達(dá)1.41TBq/mmol。標(biāo)記后穩(wěn)定性良好，24h后標(biāo)記率仍87%。免疫熒光實(shí)驗(yàn)和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)HT-1080、HUVEC、HepG2、U87Mg和PC-3細(xì)胞株CD13表達(dá)均為陽性，HT-29和MCF-7細(xì)胞株CD13為陰性表達(dá)。HT-1080細(xì)胞體外受體結(jié)合試驗(yàn)提示1h為最佳結(jié)合時(shí)間，Kd值為7.3nmol/L，Bmax為0.302nmol/L。與HT-29細(xì)胞相比，~(131)I-NGR對HT-1080細(xì)胞株的生長抑制作用更強(qiáng)，并呈一定的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系；72h時(shí)，3700MBq/L~(131)I-NGR對HT-1080的抑制率達(dá)(67.9±3.4)%。~(99)mTc-NGR標(biāo)記率90%，放化純度95%。體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，~(99)mTc-NGR在腎臟和肝臟的攝取率最高，注射后1h腫瘤攝取達(dá)（2.52±0.62）%ID/g，最高值出現(xiàn)時(shí)間8h時(shí)，達(dá)（7.26±2.71）%ID/g，12h時(shí)為（3.93±1.93）%ID/g，但在競爭性抑制組中腫瘤的攝取率僅為（1.29±0.85）%ID/g。注射后1h，SPECT顯像可見腫瘤，12h時(shí)最為清晰，除腫瘤外，其他組織器官的放射性攝取隨時(shí)間延長逐漸降低，腫瘤與肌肉組織的放射性攝取比T/NT注射后4h最高，可達(dá)3.25。制備~(99)mTc-NGR1和~(99)mTc-NGR2穩(wěn)定性好，與PBS（1N，pH值7.4）混合放置12h標(biāo)記率仍92%。細(xì)胞體外攝取實(shí)驗(yàn)顯示：經(jīng)過4h孵育后，HepG2細(xì)胞對于~(99)mTc-NGR2(1.73±0.12)%的攝取高于對~(99)mTc-NGR1(1.27±0.18)%的攝取。對皮下種植HepG2肝癌腫瘤的裸鼠模型進(jìn)行SPECT顯像，腫瘤在各時(shí)間點(diǎn)都清晰可見且腫瘤攝取明顯高于對側(cè)正常組織。與~(99)mTc-NGR1相比，~(99)mTc-NGR2腫瘤攝取高且滯留時(shí)間長，注射后1h，HepG2腫瘤對~(99)mTc-NGR2的攝取達(dá)到最高（6.22±1.22）%ID/g,而同時(shí)間點(diǎn)腫瘤對~(99)mTc-NGR1的攝取為(3.46±0.47)%ID/g。另外預(yù)先注射過量未標(biāo)記NGR2（20mg/kg）封閉后的~(99)mTc-NGR2SPECT顯像結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了~(99)mTc-NGR2與CD13受體的體內(nèi)結(jié)合特異性，生物分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果與顯像結(jié)果一致，腫瘤/肌肉比值在注射后12h達(dá)到最高為(6.37±0.54)，而封閉組降為(1.85±0.61)。 結(jié)論： ~(131)I-NGR與~(99)mTc-NGR易于制備且具有良好的放射化學(xué)性質(zhì)，均可與CD13特異性結(jié)合。~(99)mTc-NGR1、及~(99)mTc-NGR2均能使腫瘤顯像，但~(99)mTc-NGR2的腫瘤攝取及顯像優(yōu)于~(99)mTc-NGR1，表明~(99)mTc-NGR2是理想的腫瘤新生血管靶向顯像劑。該研究為進(jìn)一步開展腫瘤核素靶向治療奠定基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R817.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 孟潔如,顏真,趙寧,張英起;導(dǎo)向性人干擾素α2a工程菌的高密度發(fā)酵[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2004年23期

2 王U

本文編號：2291273