發(fā)布時(shí)間：2018-07-23 16:25

【摘要】：背景:腫瘤特異性分子影像,可以直觀地探測(cè)到腫瘤高表達(dá)的生物標(biāo)志物,是腫瘤精確診斷、治療靶點(diǎn)篩選以及治療療效監(jiān)測(cè)的重要工具。腫瘤新生血管標(biāo)志物,已被證明是一種有效的特異的分子成像靶點(diǎn)。CD13是一種膜外肽酶,在腫瘤新生血管內(nèi)皮和多種腫瘤細(xì)胞高表達(dá),是公認(rèn)的腫瘤診斷和治療的靶點(diǎn)。包含NGR序列的多肽,是CD13的特異性配體,可作為CD13顯像的靶向分子。用放射性核素64Cu、99mTc及68Ga標(biāo)記NGR探針的顯像效率和特異性已經(jīng)被驗(yàn)證。然而,跟傳統(tǒng)的PET顯像劑18F-FDG相比,NGR多肽探針的主要局限性在于腫瘤中較低的攝取水平和較短的滯留時(shí)間。上述局限性不僅存在于NGR探針,而是小分子多肽探針的共性問(wèn)題。分析其原因主要有兩個(gè)方面:首先,多肽探針由于其小分子量和較大的極性,腎臟排泄迅速,導(dǎo)致其血漿半衰期很短,進(jìn)而在腫瘤的攝取很低。另外,因?yàn)槎嚯奶结橂y以滲透進(jìn)腫瘤組織深部,只能與新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面有限的cd13位點(diǎn)暫時(shí)性結(jié)合,導(dǎo)致在腫瘤組織的低攝取和滯留時(shí)間很短。cendr序列(r/kxxr/k)是c-末端為精氨酸或賴(lài)氨酸殘基的c-末端序列,通過(guò)與nrp-1相互作用,能夠引導(dǎo)多肽穿過(guò)血管等生物屏障,提高滲透與滯留能力。sugahara等通過(guò)將cendr序列插入另一種腫瘤特異性的血管靶向多肽rgd合成irgd(internalizingrgd,包含cendr序列和rgd序列),結(jié)果表明irgd包被的納米顆粒能特異性地從腫瘤新生血管滲透進(jìn)腫瘤組織和細(xì)胞,從而顯著提高了腫瘤顯像劑的靈敏度,提供了一種增加抗腫瘤藥物有效性的技術(shù)手段。隨后,該研究團(tuán)隊(duì)將他們合成的ingr(internalizingngr,包含cendr序列和ngr序列)偶聯(lián)到納米粒子上得到了相似的效應(yīng)。本研究擬合成插入cendr序列的ingr多肽,通過(guò)與nrp-1相互作用介導(dǎo)ngr肽滲透進(jìn)腫瘤組織,增加ngr探針在腫瘤的攝取和滯留,從而為增強(qiáng)放射性多肽探針對(duì)腫瘤的顯像效能提供一個(gè)新的途徑。目的:評(píng)價(jià)包含ngr靶向序列和cendr(r/kxxr/k)滲透序列的新型分子探針68ga-dota-ingr在cd13表達(dá)陽(yáng)性移植瘤的micropet顯像效能,并通過(guò)阻斷實(shí)驗(yàn)闡述nrp-1的作用機(jī)制。方法:1、參照sugahara等的研究[1,2],將cendr序列插入ngr,并與dota耦合,之間用ggg相連,構(gòu)建成前體dota-ingr(dota-gggcrngrgpdc,其中ingr通過(guò)cys4和cys12二硫鍵連接成環(huán)),并交由上海吉爾生化有限公司合成,用高效液相色譜法(high-performanceliquidchromatography,hplc)分析其純度。2、取由68ge/68ga發(fā)生器獲得的68ga新鮮淋洗液200μl(92.5-129.5mbq),通過(guò)調(diào)節(jié)ph值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間及dota-ingr多肽用量,探索最佳標(biāo)記條件。測(cè)定標(biāo)記產(chǎn)物(68ga-dota-ingr)的體外穩(wěn)定性、體內(nèi)穩(wěn)定性及脂水分配系數(shù)。正常小鼠經(jīng)尾靜脈注射68ga-dota-ingr后于10、20、40、60及120min處死,取血及主要臟器,測(cè)定重量及放射性計(jì)數(shù)。3、通過(guò)westernblot和細(xì)胞免疫熒光鑒定ht-1080和ht-29細(xì)胞的cd13和nrp-1受體表達(dá);通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn),比較dota-ingr和dota-cngr(dota-gggcngrc)與cd13受體陽(yáng)性ht-1080細(xì)胞的親和力;通過(guò)細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定68ga-dota-ingr和68ga-dota-cngr在ht-1080和ht-29細(xì)胞的攝取率;ht-1080細(xì)胞加入68ga-dota-ingr之前與1μg/ml中和nrp-1抗體孵育15min以阻斷nrp-1受體行細(xì)胞nrp-1阻斷實(shí)驗(yàn)。4、在裸鼠的兩側(cè)肩部分別建立ht-1080和ht-29移植瘤模型。比較68ga-dota-ingr和68ga-dota-cngr在荷瘤裸鼠的micropet顯像效能;將68ga-dota-ingr和未標(biāo)記的cngr(20mg/kg)共注射行競(jìng)爭(zhēng)micropet/ct顯像驗(yàn)證68ga-dota-ingr在體內(nèi)與cd13結(jié)合的能力;通過(guò)中和nrp-1抗體(50μg)阻斷nrp-1受體行micropet/ct顯像驗(yàn)證ingr通過(guò)nrp-1介導(dǎo)而提高顯像性能的作用機(jī)制。腫瘤區(qū)勾畫(huà)感興趣區(qū)(regionsofinterests,roi),用%id/g(percentageofinjecteddosepergramoftissue)表示腫瘤攝取值。結(jié)果:1、dota-ingr由吉爾生化有限公司合成,經(jīng)hplc分析,其純度95%。2、68ga放射性活度為92.5-129.5mbq時(shí),dota-ingr最少用量2μg,ph4.0,90-100℃加熱5-10min,標(biāo)記率最高,可達(dá)97.5±1.3%,放射性比活度約54-75mbq/nmol。68ga-dota-ingr在生理鹽水及鼠血清中放置4h后,放射化學(xué)純度均大于95%,在體內(nèi)代謝1h,尿液68ga-dota-ingr放射化學(xué)純度仍大于85%。脂水分配系數(shù)為-2.71±0.18。68ga-dota-ingr在小鼠體內(nèi)經(jīng)腎代謝,血液清除迅速,其他臟器放射性攝取少。3、cd13和nrp-1在ht-1080細(xì)胞高表達(dá),在ht-29細(xì)胞不表達(dá)。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)中dota-ingr和dota-cngr的ic50值分別為(4.98±1.91)×10-8m和(5.04±1.17)×10-8m,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明二者具有相同的親和力;細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)中,68ga-dota-ingr和68ga-dota-cngr都能與ht-1080細(xì)胞結(jié)合,而且細(xì)胞攝取率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加。孵育2h,68ga-dota-ingr在ht-1080細(xì)胞的最大攝取率是68ga-dota-cngr的近2倍(1.78±0.14%及0.90±0.12%,p0.05)。但是,在cd13表達(dá)陰性的ht-29細(xì)胞,68ga-dota-ingr和68ga-dota-cngr攝取率很低,孵育2h的攝取率分別為0.38±0.07%和0.26±0.05%(p0.05),明顯低于兩種探針在HT-1080細(xì)胞的攝取(P0.01)。在NRP-1受體阻斷實(shí)驗(yàn)中,HT-1080與中和NRP-1抗體孵育15 min后,68Ga-DOTA-iNGR 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的攝取率從0.50±0.08、1.08±0.07、1.54±0.10、1.78±0.14%分別降到0.26±0.09、0.58±0.10、0.86±0.11、0.96+0.12%(P0.05)。而且經(jīng)中和NRP-1抗體阻斷后,68Ga-DOTA-iNGR在HT-1080細(xì)胞的攝取率與68Ga-DOTA-cNGR無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。4、HT-1080和HT-29移植瘤模型行68Ga-DOTA-iNGR或68Ga-DOTA-cNGR microPET顯像,結(jié)果顯示,除了腎臟,與HT-29腫瘤比較,CD13表達(dá)陽(yáng)性的HT-1080腫瘤清晰顯影,且HT-1080腫瘤對(duì)68Ga-DOTA-iNGR的攝取明顯高于68Ga-DOTA-cNGR,3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(注射后0.5、1、1.5 h)兩種探針的攝取值分別為3.41±0.28、2.97±0.30、2.64±0.31%ID/g和2.68±0.35、1.91±0.32、1.45±0.30%ID/g(P0.05)。隨著時(shí)間延長(zhǎng),68Ga-DOTA-iNGR及68Ga-DOTA-cNGR的腫瘤攝取值均有所下降,其0.5 1 h的下降斜率分別為-0.74±0.22及-1.23±0.25,提示68Ga-DOTA-iNGR的腫瘤滯留時(shí)間約是68Ga-DOTA-cNGR的1.7倍(P0.05)。在阻斷實(shí)驗(yàn)中,荷瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈共注射68Ga-DOTA-iNGR和未標(biāo)記的過(guò)量的cNGR,HT-1080腫瘤的放射性攝取幾乎被完全阻斷,腫瘤攝取值從2.92±0.40下降到0.57±0.26%ID/g(P0.01)。而在注射68Ga-DOTA-iNGR前經(jīng)尾靜脈注射中和NRP-1抗體,HT-1080腫瘤的放射性攝取只被部分阻斷,腫瘤攝取值從2.96±0.43下降到1.82±0.34%ID/g(P0.05),而且結(jié)果顯示,被中和NRP-1抗體阻斷后,68Ga-DOTA-iNGR在HT-1080腫瘤的聚集程度與68Ga-DOTA-cNGR結(jié)果近似(P0.05)。結(jié)論:含有CendR基序的68Ga-DOTA-iNGR較傳統(tǒng)68Ga-DOTA-cNGR探針具有更高的腫瘤攝取和更好的腫瘤滯留,表明CendR基序修飾有望成為增強(qiáng)腫瘤靶向顯像效能的新途徑。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R730.44

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1 趙明玄;基于新型腫瘤新生血管靶向肽iNGR的腫瘤核素顯像研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：2139970