本文選題：暈動癥 + 前庭��； 參考：《第二軍醫(yī)大學》2012年博士論文

【摘要】：暈動癥是由于人體暴露于異常加速度環(huán)境所引起的多系統(tǒng)生理反應(yīng)。反復暴露于該加速度環(huán)境，能使得暈動癥癥狀減輕甚至消失，這就是適應(yīng)現(xiàn)象。脫離加速度環(huán)境一定時間后，會出現(xiàn)脫適應(yīng)現(xiàn)象。但是這種適應(yīng)脫適應(yīng)的周期性規(guī)律和其中樞機制卻不清楚。眾所周知，前庭系統(tǒng)是外界加速度信息的主要感受系統(tǒng)，前人的研究發(fā)現(xiàn)在前庭神經(jīng)元中，谷氨酸是主要的神經(jīng)遞質(zhì)，而NMDA受體也廣泛地存在于前庭核的神經(jīng)元中。大量的研究表明，NMDA受體介導的長時程增強是中樞學習記憶的神經(jīng)基礎(chǔ)，NMDA受體介導的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應(yīng)主要是通過谷氨酸激活NMDA受體后通過鈣/鈣調(diào)蛋白依賴型激酶II（Ca2+/CaMKII）途徑，最終激活cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB），而磷酸化的CREB也作為轉(zhuǎn)錄因子可進一步誘導及早基因c-fos以及腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）等新基因的表達。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)Fos蛋白能作為前庭核神經(jīng)元激活的分子標志，并且谷氨酸能神經(jīng)元前庭內(nèi)臟投射通路能被旋轉(zhuǎn)刺激所激活。另外，大量研究證實，海馬是記憶相關(guān)的重要腦區(qū)，前庭與海馬之間存在著廣泛的聯(lián)系，前庭系統(tǒng)的激活能影響海馬的功能和海馬相關(guān)的學習記憶能力。本研究首先觀察了暈動癥大鼠的行為學變化和適應(yīng)-脫適應(yīng)規(guī)律，，進一步采用分子生物學方法觀察NMDA受體信號通路在暈動癥適應(yīng)-脫適應(yīng)過程中的變化，最后采用藥理學手段阻斷該信號通路，觀察對暈動癥適應(yīng)-脫適應(yīng)過程的影響。 方法 一、暈動癥適應(yīng)-脫適應(yīng)動物模型的建立 1、實驗動物及分組550只健康雄性SD大鼠，體重220-250g。 （1）長時刺激實驗100只動物完全隨機分為10組：旋轉(zhuǎn)刺激4h組，靜止對照4h組，1h旋轉(zhuǎn)組，1h靜止組，2h旋轉(zhuǎn)組，2h靜止組，3h旋轉(zhuǎn)組，3h靜止組，4h旋轉(zhuǎn)組，4h靜止組，每組10只。前2組記錄每小時的實時行為學變化，后8組記錄自發(fā)活動變化。 （2）東莨菪堿干預實驗90只動物完全隨機分為9組：自由活動對照組，靜止對照組，旋轉(zhuǎn)對照組，東莨菪堿旋轉(zhuǎn)組（ISco0.5mg/kg），東莨菪堿靜止組I，東莨菪堿旋轉(zhuǎn)組I（ISco1.0mg/kg），東莨菪堿靜止組II，溶劑旋轉(zhuǎn)組，溶劑靜止組，每組10只。藥物及溶劑組為刺激前30min給藥（1ml/只，i.g.）。 （3）雙側(cè)迷路切除實驗40只動物完全隨機分為4組：雙側(cè)迷路切除旋轉(zhuǎn)組，雙側(cè)迷路切除靜止組，假手術(shù)旋轉(zhuǎn)組，假手術(shù)靜止組，每組10只。手術(shù)后4周進行刺激實驗。 （4）適應(yīng)規(guī)律實驗40只動物完全隨機分為2組：旋轉(zhuǎn)刺激2h/d組、靜止對照2h/d組，每組20只，每天進行模擬暈動刺激，實時觀察行為學變化。100只動物完全隨機分為10組：旋轉(zhuǎn)刺激2h-1d組、2h-4d組、2h-7d組、2h-10d組、2h-13d組，和與各自時間對應(yīng)的靜止對照組，每組10只，記錄自發(fā)活動變化。 （5）脫適應(yīng)規(guī)律實驗180只動物完全隨機分為18組：脫適應(yīng)5d，7d，14d，21d，28d，35d組及相應(yīng)天數(shù)刺激對照組，靜止對照組，每組10只。脫適應(yīng)組動物首先進行暈動刺激至適應(yīng)，連續(xù)9d，每天2h，后正常飼養(yǎng)至相應(yīng)脫適應(yīng)天數(shù)，再進行一次2h暈動刺激，記錄實時行為學變化和自發(fā)活動變化。 2、雙側(cè)迷路切除手術(shù)及假手術(shù)3%戊巴比妥那麻醉后，將大鼠側(cè)臥位置于手術(shù)顯微鏡下，剪開耳后皮膚，鈍性分離軟組織，暴露外耳道外壁，剪開外耳道，暴露鼓膜及鼓室，觀察聽小骨清晰后，尋找圓窗及卵圓窗，用五號注射器針頭挑開鼓泡，除去部分骨質(zhì)，用尖頭鑷探查內(nèi)耳，剪除內(nèi)耳骨部，挑出內(nèi)耳，用左氧氟沙星粉劑敷于內(nèi)耳，防止感染，縫合外耳道及耳后部皮膚，存活24h后，重新進行另一側(cè)內(nèi)耳切除手術(shù)。假手術(shù)過程與雙側(cè)內(nèi)耳切除手術(shù)相同，區(qū)別在于剪除內(nèi)耳骨部后，不觸及內(nèi)耳半規(guī)管。動物正常飼養(yǎng)恢復4周后，進行旋轉(zhuǎn)刺激。 3、模擬暈動癥刺激及行為學測量暈動癥模擬器根據(jù)Crampton等的報道仿制而成。將代謝盒放入暈動癥模擬器的有機玻璃籠內(nèi)，旋轉(zhuǎn)刺激組大鼠無束縛的放置于代謝盒的鐵絲網(wǎng)上進行旋轉(zhuǎn)刺激。實時行為學測量：刺激結(jié)束后，立即計量鐵絲網(wǎng)上的糞便顆粒數(shù)、尿液槽中的尿液量、飼料槽中飼料攝入量、高嶺土槽中高嶺土攝入量。高嶺土攝入量（24h）測量：每天10:00自動動物代謝監(jiān)測系統(tǒng)（CLAMS）自動記錄。自發(fā)活動測量：采用DigBehav動物行為分析系統(tǒng)記錄動物3min的運動。 二、前庭核NMDA受體信號通路在暈動癥適應(yīng)-脫適應(yīng)過程中的作用 1、實驗動物及分組128只健康雄性SD大鼠，體重220-250g。80只動物完全隨機分為10組：旋轉(zhuǎn)刺激組1d，4d，7d，10d，13d及相應(yīng)的靜止對照組，每組8只，用于進行western blot和實時定量PCR實驗。48只動物完全隨機分為6組：旋轉(zhuǎn)刺激組1d，4d，7d，10d，13d及靜止對照組，每組8只，用于進行免疫組織化學及免疫熒光組織化學實驗。 2、分子生物學實驗采用Western blot法測定尾側(cè)前庭核內(nèi)NMDA R1受體、NMDA R2A/B受體、GABAAα1亞基、CaMKIIα亞基、磷酸化CaMKIIα亞基、CREB、磷酸化CREB蛋白含量。 采用實時定量PCR法測定尾側(cè)前庭核內(nèi)Fos、Arc、BDNF mRNA表達水平。 采用免疫組織化學法觀察尾側(cè)前庭核內(nèi)Fos標記神經(jīng)元數(shù)量。 采用免疫熒光組織化學法觀察尾側(cè)前庭核內(nèi)GABAAα1標記神經(jīng)元、Arc標記神經(jīng)元、GABAAα1/Arc共標記神經(jīng)元數(shù)量。 三、海馬NMDA受體信號通路在暈動癥適應(yīng)-脫適應(yīng)過程中的作用 1、實驗動物及分組260只健康雄性SD大鼠，體重220-250g。80只動物完全隨機分為10組：旋轉(zhuǎn)刺激組1d，4d，7d，10d，13d及相應(yīng)的靜止對照組，每組8只，用于進行western blot和實時定量PCR實驗。30只動物完全隨機分為6組：脫適應(yīng)組1d，4d，7d，14d，21d及靜止對照組（Sta），每組5只，用于進行western blot實驗。150只動物完全隨機分為15組：抑制劑組2d，4d，6d，8d，10d及相應(yīng)生理鹽水對照組、脫適應(yīng)對照組，每組10只。 2、雙側(cè)海馬內(nèi)微注射3%戊巴比妥那麻醉后，將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上，切開顱頂部皮膚，暴露前囟點，以前囟點為原點定位雙側(cè)海馬中心部（AP3.8mm；ML2.3mm；DV3.0mm），打開顱骨，插入進樣導管，牙科水泥固定導管于顱骨表面，左氧氟沙星粉劑敷于顱骨表面，縫合顱頂部皮膚，蓋上導管帽。后正常飼養(yǎng)7d，前3d每天腹腔注射1ml左氧氟沙星注射液防治感染。乙醚麻醉大鼠后，打開導管帽，以注射管將0.5μl20nmol/μl KN-93緩慢注射至海馬中心部，留針1min，緩慢拔針，蓋上導管帽。 3、行為學實驗旋轉(zhuǎn)刺激同第一部分，所有動物首先進行連續(xù)9d，每天2h的暈動刺激至適應(yīng)；抑制劑組與生理鹽水對照組動物每天雙側(cè)海馬內(nèi)微注射CaMKII抑制劑KN-93或生理鹽水至相應(yīng)脫適應(yīng)天數(shù)后，進行2h暈動刺激記錄實時行為學變化及自發(fā)活動變化；脫適應(yīng)對照組正常飼養(yǎng)至相應(yīng)脫適應(yīng)天數(shù)后，進行2h暈動刺激記錄實時行為學變化及自發(fā)活動變化。 4、分子生物學實驗采用Western blot法測定海馬內(nèi)NMDA R1受體、NMDA R2A/B、CaMKIIα亞基、磷酸化CaMKII α亞基、CREB、磷酸化CREB蛋白含量。采用實時定量熒光PCR法測定海馬內(nèi)Fos、Arc、BDNF mRNA表達水平。 四、統(tǒng)計學分析采用SPSS v13.0軟件進行統(tǒng)計分析。適應(yīng)規(guī)律、脫適應(yīng)規(guī)律、Western blot及PCR實驗中，兩因素多水平方差分析用來統(tǒng)計整個處理過程中旋轉(zhuǎn)刺激、時間的主因素效應(yīng)和交互作用效應(yīng)有無顯著性差異。當交互效應(yīng)存在的情況下，單因素方差分析及Bonferroni檢驗用來分析相對應(yīng)的時間點，旋轉(zhuǎn)刺激組和靜止對照組之間的差異。行為學指標篩選實驗中，方差分析Bonferroni檢驗用來分析相對應(yīng)的時間點，旋轉(zhuǎn)刺激組和靜止對照組之間的差異。免疫組織化學及免疫熒光組織化學實驗中，單因素方差分析及Dunnett-t檢驗用來統(tǒng)計尾側(cè)前庭核中標記神經(jīng)元數(shù)目有無差別。 結(jié)果 一、暈動癥適應(yīng)-脫適應(yīng)動物模型的建立 1、長時刺激對暈動癥行為學的影響統(tǒng)計分析顯示，與靜止對照組（Sta）相比，糞便顆粒數(shù)在刺激的第1、2小時增加（P0.05），在第3、4小時下降至對照水平（P0.05）；自發(fā)活動量和活動次數(shù)均在第1、2小時降低（P0.05），在第3、4小時上升到接近對照組水平（P0.05）；24h高嶺土攝入量在4h中均增加（P0.05）。尿液量無顯著變化（P0.05）。 2、東莨菪堿對暈動癥行為學的影響統(tǒng)計分析顯示，與溶劑組相比，給予東莨菪堿0.5mg/kg和1.0mg/kg后，兩個劑量均可以減少糞便顆粒數(shù)與24h高嶺土攝入量，增加自發(fā)活動量和活動次數(shù)（P0.05）。由于灌胃給予溶液的原因，使得所有動物的尿液量均增加（P0.05）。 3、雙側(cè)內(nèi)耳切除術(shù)對暈動癥行為學的影響統(tǒng)計分析顯示，雙側(cè)迷路切除組動物的糞便顆粒數(shù)、24h高嶺土攝入量、自發(fā)活動量和自發(fā)活動次數(shù)均與靜止對照組無明顯差別（P0.05），與暈動刺激對照組有差別（P0.05）；假手術(shù)組動物各指標均與暈動刺激對照組無差別（P0.05）。 4、適應(yīng)規(guī)律觀察實驗統(tǒng)計分析顯示暈動刺激組和靜止對照組動物的糞便顆粒數(shù)在暈動刺激第1天到第8天有顯著差異（P0.05），在第9天到第14天無差別（P0.05）；實時高嶺土攝入量在暈動刺激第3天到第27天有顯著差異（P0.05），在第29天到第33天無差別（P0.05）；24h高嶺土攝入量在暈動刺激第3天到第29天有顯著差異（P0.05），在第31天到第33天無差別（P0.05）。與靜止對照組相比，自發(fā)活動量和活動次數(shù)均在暈動刺激第1、4天降低（P0.05），第7天恢復到對照組水平（P0.05）。 5、脫適應(yīng)規(guī)律觀察實驗糞便顆粒數(shù)在脫適應(yīng)5d仍維持在靜止對照組水平（P0.05），在脫適應(yīng)7d達到旋轉(zhuǎn)對照組水平。自發(fā)活動量和活動次數(shù)隨著脫適應(yīng)天數(shù)的增加而增加，在第21天顯示與旋轉(zhuǎn)對照組無明顯差異（P0.05），這說明其已經(jīng)達到脫適應(yīng)水平。其它指標也顯示部分脫適應(yīng)組與對照組有差別，但都沒有規(guī)律性。 二、前庭核NMDA受體信號通路在暈動癥適應(yīng)-脫適應(yīng)過程中的作用 1、暈動癥適應(yīng)過程中尾側(cè)前庭核NR1、NR2A/B、GABAAα1蛋白水平和αCaMKII、CREB蛋白磷酸化水平的變化統(tǒng)計分析顯示旋轉(zhuǎn)刺激組動物的GABAAα1蛋白水平、αCaMKII蛋白磷酸化水平在暈動刺激第1、4天增加（P0.05），第7天恢復到靜止對照組水平（P0.05）；CREB蛋白磷酸化水平在暈動刺激第1、4、7、10天增加（P0.05），第13天恢復到靜止對照組水平（P0.05）；NR1和NR2A/B蛋白水平無顯著變化（P0.05）。 2、暈動癥適應(yīng)過程中尾側(cè)前庭核Fos、Arc和BDNFmRNA表達水平的變化統(tǒng)計分析顯示旋轉(zhuǎn)刺激組動物的Fos mRNA表達水平在暈動刺激第1、4天增加（P0.05），Arc mRNA表達水平在暈動癥第1、4天減少（P0.05），均在第7天恢復到靜止對照水平（P0.05）；BDNF mRNA表達水平無顯著變化（P0.05）。 3、暈動癥適應(yīng)過程中Fos在尾側(cè)前庭核神經(jīng)元中表達的變化方差分析顯示SpVe和MVe中的Fos標記神經(jīng)元在旋轉(zhuǎn)刺激組和對照組之間均有顯著差別（P0.01）。Dunnett-t test顯示在暈動刺激第1、4、7天，F(xiàn)os標記神經(jīng)元增加（P0.05），在刺激第10天起恢復到對照水平（P0.05）。 4、暈動癥適應(yīng)過程中GABAAα1和Arc在尾側(cè)前庭核神經(jīng)元中共表達方差分析顯示Arc標記神經(jīng)元、GABAAα1標記神經(jīng)元和GABAAα1/Arc共標記神經(jīng)元在旋轉(zhuǎn)刺激組和對照組之間有顯著差別（p0.01）。Dunnett-t test顯示在暈動刺激第1、4天，GABAAα1標記神經(jīng)元增加（P0.05），Arc標記神經(jīng)元和GABAAα1/Arc共標記神經(jīng)元減少（P0.05），在刺激第7天起恢復到對照水平（P0.05）。 三、海馬NMDA受體信號通路在暈動癥適應(yīng)-脫適應(yīng)過程中的作用 1、暈動癥適應(yīng)過程中海馬NR1、NR2A/B蛋白水平和αCaMKII、CREB蛋白磷酸化水平的變化統(tǒng)計分析顯示，旋轉(zhuǎn)刺激組動物αCaMKII蛋白磷酸化水平在暈動刺激第1、4、7、10天無顯著變化（P0.05），第13天升高（P0.05）；CREB蛋白磷酸化水平在暈動刺激第1、4、7、10天緩慢增加（P0.05），第13天與靜止對照組相比顯著升高（P0.05）；NR1和NR2A/B蛋白水平無顯著變化（P0.05）。 2、暈動癥適應(yīng)過程中海馬Fos、Arc和BDNF mRNA表達水平的變化統(tǒng)計分析顯示，F(xiàn)os、Arc、BDNF mRNA表達水平在旋轉(zhuǎn)刺激組和靜止對照組之間無明顯差別（P0.05）。 3、暈動癥脫適應(yīng)過程中海馬αCaMKII、CREB蛋白磷酸化水平變化統(tǒng)計分析顯示，αCaMKII蛋白磷酸化水平在脫適應(yīng)第1天無明顯變化（P0.05），在第4、7、14天升高（P0.05），第21天恢復到對照水平（P0.05）。統(tǒng)計分析顯示， CREB蛋白磷酸化水平在暈動刺激第1、4天升高（P0.05），第7、14、21天恢復到對照水平（P0.05）。 4、KN-93對暈動癥脫適應(yīng)行為學的影響統(tǒng)計分析顯示，糞便顆粒數(shù)、自發(fā)活動量、活動次數(shù)在各時間點的生理鹽水組和脫適應(yīng)組之間均無差別（P0.05）。抑制劑組動物的糞便顆粒數(shù)在脫適應(yīng)6、8、10d增加（P0.05），自發(fā)活動量在脫適應(yīng)6、10d降低（P0.05），活動次數(shù)在脫適應(yīng)6、8、10d降低（P0.05）。 結(jié)論 1、與異嗜高嶺土行為比較，排便量和自發(fā)活動是大鼠暈動癥判斷較為敏感和可靠的指標，其中糞便顆粒計數(shù)操作簡單，不易出現(xiàn)測量誤差；暈動刺激后的自發(fā)活動也是暈動癥敏感的行為學指標，綜合運用這些指標有利于提高大鼠暈動癥嚴重程度判斷的準確性，是較為可靠的暈動癥行為學實驗方法；24h高嶺土攝入量作為使用廣泛的指標，也能反映大鼠暈動癥癥狀，但其表現(xiàn)具有一定的延遲性。 2、糞便顆粒數(shù)的適應(yīng)時間為9d，脫適應(yīng)時間為7d；自發(fā)活動量和活動次數(shù)的適應(yīng)時間為7d，脫適應(yīng)時間為21d。指標不一致的原因可能是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和自主神經(jīng)系統(tǒng)反映的不一致性引起的，因此，暈動癥完全適應(yīng)時間為9d，完全脫適應(yīng)時間為21d。 3、在暈動癥癥狀期（1、4d），大鼠尾側(cè)前庭核中CaMKIIα、CREB活性和FosmRNA、蛋白表達水平升高，GABAAα1受體蛋白水平升高，Arc mRNA表達水平下降；在適應(yīng)期（13d），CaMKIIα活性，F(xiàn)os、Arc mRNA表達水平和Fos、GABAAα1受體蛋白水平均恢復到對照組水平。并且這些分子的改變與暈動癥適應(yīng)過程中行為學改變有明顯相關(guān)性，說明大鼠尾側(cè)前庭核中NMDA受體信號通路活性和GABAAα1受體水平的升高與暈動癥適應(yīng)的形成是相關(guān)的，可能為暈動癥的適應(yīng)提供了分子基礎(chǔ)。 4、在暈動癥適應(yīng)期，大鼠海馬中CaMKIIα、CREB活性升高，并一直延續(xù)到脫適應(yīng)期，并于暈動癥脫適應(yīng)行為學改變有一定相關(guān)性，采用CaMKIIα抑制劑KN-93預處理可以明顯提前暈動癥脫適應(yīng)時間，說明大鼠海馬中NMDA受體信號通路活性升高與暈動癥適應(yīng)的維持是相關(guān)的，在暈動癥適應(yīng)的維持中起一定作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R82

【參考文獻】

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本文編號：1936906