本文選題：混合DNA + 混合比例��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2013年碩士論文

【摘要】：目的：混合DNA分析是法醫(yī)學(xué)中一個具有挑戰(zhàn)性的難題。由于混合DNA中各種組分難以分離，混合DNA的基因分型結(jié)果表現(xiàn)為各組分的等位基因相互并存、相互重疊的現(xiàn)象，導(dǎo)致結(jié)果的分析異常復(fù)雜。對于法醫(yī)實(shí)踐中常見的混合DNA的短串聯(lián)重復(fù)序列（shorttandem repeats,STR）分型圖譜，首先判斷是否為混合DNA，其次判斷是幾個個體混合，然后推斷各組分的混合比例，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步推斷各成分可能的基因型�；旌媳壤茢嗟恼_與否直接影響各組分基因型的推斷結(jié)果，因此，混合比例推斷是混合DNA分析中的一個關(guān)鍵問題。本課題擬從兩方面研究影響混合DNA分析中混合比例推斷的因素：1）Quantifile rDuo Quantification試劑盒初始DNA定量結(jié)果，2）Identifiler試劑盒基因分型圖譜中各等位基因的峰型信息，旨在為準(zhǔn)確推斷混合比例提供有價值的指導(dǎo)和建議。 方法： 1單一樣本雜合型均衡比（Heterozygote balance,Hb）的評估：按照知情同意原則，采集180份健康無關(guān)個體靜脈血5ml。用QIAampDNABloodMidi試劑盒提取全血基因組DNA，并用AmpFLSTRIdentifiler試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用ABI3130Genetic Analyzer對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分型，使用Gene Mapperv3.2分析結(jié)果。另外，，隨機(jī)選擇本實(shí)驗(yàn)室2012年使用本儀器獲得的120個案件樣本的STR分型圖譜，計(jì)算上述300個樣本每個基因座的雜合型均衡比。 2混合DNA模型制備：取女性標(biāo)準(zhǔn)品DNA9947A和男性標(biāo)準(zhǔn)品DNA2800M，另隨機(jī)選取一個男性DNA樣本和一個女性DNA樣本（分別命名為M、F），用Quantifiler Duo DNA Quantification試劑盒對4個DNA樣本進(jìn)行定量。根據(jù)定量結(jié)果，將9947A、2800M稀釋為0.5ng/μl，樣本M、F稀釋為1ng/μl。將2800M和9947A、M和F進(jìn)行混合，混合比率（mixtureratio,Mr）為：1:13、1:11、1:9、1:7、1:5、1:3、1:1、3:1、5:1、7:1、9:1、11:1、13:1。 3混合DNA定量：用Quantifiler Duo DNA Quantification試劑盒對上述制備的混合DNA樣本進(jìn)行定量，平行試驗(yàn)三次。用AB公司7500SDS軟件V1.4.3分析混合DNA定量結(jié)果。統(tǒng)計(jì)男性DNA以及總DNA的量，計(jì)算混合比例，進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。 4混合DNA樣本STR分型：用AmpFLSTR Identifiler試劑盒擴(kuò)增混合DNA樣本（2800M-9947A，M-F，ABI3130Genetic Analyzer對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分型，使用Gene Mapperv3.2分析結(jié)果，平時試驗(yàn)三次。統(tǒng)計(jì)每個等位基因的峰高信息，根據(jù)混合比例公式計(jì)算混合比例并進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：對上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算以下參數(shù)：H_b、APH、M_x、M_r、 D′值、D值、殘差值、平均殘差值。H_b為一個雜合子兩個不同的等位基因峰高比值，計(jì)算公式：H_b1=φsmaller/φlonger，φsmaller表示峰值較低的等位基因的峰高，φlonger表示峰值較高的峰高。平均峰高(Averagepeakheight，APH)雜合子的平均峰高為兩等位基因峰高之和的一半�；旌媳壤╩ixture proportion,Mx）表示混合DNA中某一組分的DNA在混合DNA中所占的比例�；旌媳壤碚撝涤肕_x表示，實(shí)時熒光定量計(jì)算所得的混合比例用M′_x表示，根據(jù)STR分型圖譜推斷的混合比例用M_x~l表示。D值為M_x~l與M_x差值的絕對值，D′值為M′_x與M_x差值的絕對值�；旌媳嚷剩╩ixtureratio,M_r）表示混合DNA中各組分之間DNA量的比值。殘差值=∑D~2，平均殘差值用殘差′表示。殘差′=∑D~2／n，n為所檢測的基因座的數(shù)目。應(yīng)用Eccell,SPSS16.0軟件對上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用的統(tǒng)計(jì)方法包括配對t檢驗(yàn)，Mann-whiteneyU檢驗(yàn)，Kruakal-wallis檢驗(yàn),wilcoxon SignedRanks。 結(jié)果： 1單一樣本雜合型均衡比（Heterozygote balance,H_b）的評估對180個血液樣本提取的DNA進(jìn)行STR分型，統(tǒng)計(jì)分析H_b的分布 情況，結(jié)果顯示所有樣本的所有等位基因H_b均大于0.4，99.9%的樣本H_b0.5，99.5%的樣本H_b0.6。120個案件樣本的H_b分布情況：H_b0.4、H_b0.5、H_b0.6的分別占樣本總量的100%、99.4%、96.7%。300個樣本綜合統(tǒng)計(jì)，H_b0.6的占98.4%。其中D18S51,D2S1338基因座的H_b中位數(shù)值最低，為84.6%和85.6%。其余14個基因座H_b中位數(shù)均大于86.0%。D3S1358和Amelogenin基因座的H_b中位數(shù)最高，分別為90.0%和89.8%。 2混合DNA的Duo DNA Quantification定量結(jié)果對混合比例推斷的影響2800M-9947A混合DNA的M_x與M′_x之間沒有顯著性差異。F-M混合DNA的M_x與M′_x之間有顯著性差異。兩組混合DNA的D′值均小于0.11。M_r＜1組和M_r＞1組的D′值分布有顯著性差異，M_r＞1組的D′值大于M_r＜1組的D′值，即隨著男性DNA成分在混合DNA中的比例不斷增大，D′值也在不斷增大，表明男性成分占主要成分時，使用該試劑盒檢測并計(jì)算得出的混合比例與理論值具有較大差異。M-F混合DNA在M_r為11:1、13:1時，實(shí)時熒光定量結(jié)果顯示男性DNA的量大于總DNA的量，故無法得到M′_x。說明當(dāng)混合樣本中男性成分所占比例大于91%時，應(yīng)用Duo DNA Quantification試劑盒無法得到準(zhǔn)確的混合比例數(shù)據(jù)。 3Identifiler試劑盒基因分型結(jié)果對混合比例推斷的影響 3.1初始混合比例對M_x~l推斷的影響 比較不同混合比率樣本之間的D值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)M_r＜1組6個混合比率的D值沒有差異，M_r＞1組的6個混合比率的D值之間也沒有差異。2800M-9947A混合樣本中，M_r＞1組的D值較M_r＜1組大，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。M-F混合樣本中，M_r＞1組與M_r＜1組的D值之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2800M-9947A混合DNA樣本中，D7S820的D值較大，其中7個D值大于0.25，4個D值大于0.35，其余15個基因座的D值都在0.35以下。D21S11基因座和D16S539基因座在1:13和13:1混合比率時出現(xiàn)了等位基因丟失。95.1%的D值小于0.10。M-F混合樣本的D值都在0.35以下，未出現(xiàn)等位基因丟失，96.2%的D值在0.10以下。 3.2基因座對M_x~l推斷的影響 對于2800M-9947A混合樣本和M-F混合樣本，分別計(jì)算了15個STR基因座和Amelogenin性別基因座13個混合比率的的D值和殘差值，對殘差值進(jìn)行Kruskal-wallis檢驗(yàn)，結(jié)果顯示16個基因座之間的殘差值具有顯著差異，說明該16個基因座對于混合比例的推斷是有差異的。將16個基因座的M_x~l和M_x進(jìn)行配對t檢驗(yàn)和Wilcoxon Signed Ranks檢驗(yàn)，結(jié)果顯示2800M-9947A混合樣本M_x~l與M_x沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因座包括：CSF1PO、D5S818、D16S539、D18S51、FGA和vWA，其它的基因座均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。M-F混合樣本M_x~l與M_x沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因座包括：D2S1338、D7S820、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、TPOX、vWA�？梢娫趦山M混合DNA樣本M_x~l與M_x都沒有差異的基因座包括vWA、D18S51、D16S539；都有差異的基因座為Amel、D3S1358、D13S317、TH01、D8S1179。殘差值結(jié)果也顯示，兩組混合樣本中vWA、D18S51、D16S539的殘差值較小，而Amel、D3S1358、D13S317、TH01,D8S1179的殘差值較大。 3.3等位基因共享對M_x~l推斷的影響 2800M和9947A混合DNA樣本中，有等位基因共享的基因座的平均殘差值為0.182，無等位基因共享的平均殘差值為0.022，表明無等位基因共享的較有等位基因共享的殘差值要小。進(jìn)一步比較無等位基因共享的基因型組合類型的殘差值，發(fā)現(xiàn)4個等位基因的平均殘差值為0.025,3個等位基因的平均殘差值為0.023,2個等位基因的平均殘差值為0.012。即無等位基因共享組中有2個等位基因（BB：AA）的平均殘差值最小。 M-F混合DNA樣本中，存在等位基因共享的基因座的平均殘差值為0.048，無等位基因共享的為0.012。無等位基因共享的基因座中，有4個等位基因的基因座平均殘差值為0.015，3個等位基因的平均殘差值為0.010,2個等位基因的平均殘差值為0.008。 以上結(jié)果說明無等位基因共享比存在等位基因共享的基因座對于混合比例的推斷更加精確，在無等位基因共享的三種形式中，只有2個等位基因的基因座對于混合比例的推斷最準(zhǔn)確。 結(jié)論： 1混合DNA分析進(jìn)行混合比例推斷時，可首先應(yīng)用Quantifiler DuoQuantification試劑盒進(jìn)行初始DNA定量，并獲得兩樣本的混合比例。但該試劑盒所得的的混合比例在女性樣本為主要成分時較準(zhǔn)確，男性樣本為主要成分時準(zhǔn)確性相對較低，當(dāng)男性樣本所占比例大于91%時，甚至無法得到混合比例的數(shù)據(jù)。 2依據(jù)基因分型圖譜推斷混合比例時，無等位基因共享的基因座推斷的混合比例較有等位基因共享的基因座更準(zhǔn)確。因此，Amelogenin基因座并不是最佳選擇，建議首先選擇無等位基因共享的基因座推斷混合比例。
[Abstract]:Objective: mixed DNA analysis is a challenging problem in forensic medicine. Due to the difficulty of separating various components in mixed DNA, the genetic typing results of mixed DNA are characterized by the coexistence of alleles in each component and overlapping of each other, resulting in an abnormal complex analysis of the results. Shorttandem repeats (STR) classification map, first judge whether it is mixed DNA, then judge the mixture of several individuals, and then infer the mixture ratio of each component, on this basis, further infer the possible genotypes of each component. Proportionality inference is a key problem in mixed DNA analysis. This topic intends to study factors affecting mixed proportion inference in mixed DNA analysis from two aspects: 1) initial DNA quantitative results of Quantifile rDuo Quantification kit, 2) peak type information of each allele in the gene typing map of Identifiler kit, aiming at accurate push The ratio of breaking and mixing provides valuable guidance and advice.
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本文編號：1854227