本文選題：芥子氣　切入點(diǎn)：二乙烯砜　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：芥子氣是一種歷史悠久的化學(xué)戰(zhàn)劑,能夠引起糜爛性的毒性損傷。自1917年德國(guó)率先使用后,各國(guó)軍隊(duì)紛紛效仿,在數(shù)次戰(zhàn)爭(zhēng)中造成了嚴(yán)重的軍民傷亡。芥子氣的化學(xué)性質(zhì)活潑,能夠與皮膚、眼和呼吸道等多種組織器官發(fā)生反應(yīng),引起中毒損傷。皮膚面積大,最先與芥子氣接觸,是中毒損傷的第一靶器官。芥子氣中毒機(jī)制復(fù)雜,自合成至今尚未完全研究透徹。目前有DNA烴化損傷、PARP激活、炎癥反應(yīng)、谷胱甘肽耗竭、蛋白水解酶激活、細(xì)胞凋亡和鈣穩(wěn)態(tài)失衡等多種假說(shuō),但DNA烴化損傷卻被普遍認(rèn)為是芥子氣廣泛毒性作用的基礎(chǔ)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,芥子氣在生物體內(nèi)經(jīng)過(guò)水解、氧化等作用,會(huì)生成多種代謝產(chǎn)物。芥子亞砜作為一種砜類代謝物能夠繼續(xù)氧化生成芥子砜,然而芥子砜的化學(xué)性質(zhì)非�；顫�,能夠快速轉(zhuǎn)化為二乙烯砜。這些砜類代謝產(chǎn)物毒性作用是什么,是否對(duì)DNA具有損傷作用目前均不清楚。目的本課題采用Haca T細(xì)胞作為毒性評(píng)價(jià)模型研究芥子氣與二乙烯砜的細(xì)胞毒性及DNA損傷毒性,旨在比較芥子氣與二乙烯砜的毒性大小并揭示DNA損傷的作用模式,為闡明芥子氣的毒性機(jī)制及相關(guān)防治藥物的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法將芥子氣配制成6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM、300μM、400μM染毒液,將二乙烯砜配制成3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM染毒液,采用CCK-8試劑盒和LDH試劑盒檢測(cè)芥子氣與二乙烯砜分別染毒24小時(shí)Haca T細(xì)胞的存活率及LDH漏出率;采用倒置顯微鏡觀察芥子氣與二乙烯砜分別染毒24小時(shí)Haca T細(xì)胞的形態(tài)變化;采用Annexin V-FITC試劑盒檢測(cè)芥子氣與二乙烯砜分別染毒24小時(shí)Haca T細(xì)胞的凋亡指數(shù);采用單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)評(píng)價(jià)芥子氣與二乙烯砜分別染毒24小時(shí)DNA斷裂損傷情況;采用熒光定量PCR檢測(cè)芥子氣與二乙烯砜分別染毒6小時(shí)、12小時(shí)以及24小時(shí)同源重組修復(fù)RAD51,核苷酸切除修復(fù)XPC、XPD,堿基切除修復(fù)AAG、APEX1,直接移除修復(fù)MGMT、ABH3,和非同源末端連接修復(fù)KU70、KU80等基因的表達(dá)變化;采用蛋白印記試驗(yàn)檢測(cè)芥子氣與二乙烯砜分別染毒24小時(shí)DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白γH2AX、PARP、p53和磷酸化p53的表達(dá)變化。結(jié)果與討論Haca T細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示,不同濃度的芥子氣對(duì)Haca T細(xì)胞的增殖均有抑制作用,在一定劑量范圍內(nèi),并呈明顯的劑量依賴性,其半數(shù)抑制濃度IC50值為121μM;細(xì)胞膜的完整性能夠影響LDH的漏出,芥子氣染毒后,LDH漏出率呈先增加后降低的趨勢(shì)。在一定劑量范圍內(nèi),隨著染毒濃度的增加,細(xì)胞膜受到的損傷越來(lái)越嚴(yán)重,導(dǎo)致LDH漏出率逐漸升高;當(dāng)染毒濃度達(dá)到一定劑量時(shí),大量細(xì)胞開(kāi)始死亡,所以LDH漏出率又出現(xiàn)了下降。通過(guò)顯微鏡觀察可以發(fā)現(xiàn),隨著染毒劑量的增加,細(xì)胞皺縮變圓,漂浮的死亡細(xì)胞數(shù)逐漸增多,觀察的結(jié)果與CCK-8檢測(cè)的毒性試驗(yàn)結(jié)果較為一致。二乙烯砜細(xì)胞毒性結(jié)果顯示,在0~25μM濃度范圍內(nèi),隨著染毒劑量的增加,細(xì)胞存活率逐漸下降,并呈劑量依賴性。但是在25μM至50μM時(shí),CCK-8檢測(cè)的細(xì)胞存活率又出現(xiàn)明顯上升,隨后在50~400μM劑量范圍內(nèi),細(xì)胞存活率又逐漸下降。觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),在0~25μM劑量范圍內(nèi),隨著染毒濃度增加,細(xì)胞變圓變小,死亡的細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)液中;但是在50~400μM范圍內(nèi),鏡下觀察發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中幾乎沒(méi)有漂浮的死亡細(xì)胞,細(xì)胞變圓呈貼壁狀,并且細(xì)胞內(nèi)有明顯空泡。LDH漏出率也呈先增加后降低又上升的趨勢(shì)。分析原因可能有:1.二乙烯砜作為一種砜類化合物,在一定劑量時(shí),是否與DMSO相似具有維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性的作用;2.在0~25μM劑量范圍內(nèi)二乙烯砜與細(xì)胞反應(yīng)的分子機(jī)制與50~400μM時(shí)二乙烯砜與細(xì)胞的反應(yīng)機(jī)制可能不同,在低劑量時(shí),二乙烯砜細(xì)胞毒性作用引起細(xì)胞膜的破裂,當(dāng)劑量達(dá)到某一閾值時(shí),二乙烯砜起到了類似于固定液的作用,引起細(xì)胞死亡,但仍保持細(xì)胞膜的完整性。至于具體的毒性作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)探索。Annexin是一類鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白,主要存在于細(xì)胞漿內(nèi)。細(xì)胞在受到損傷發(fā)生凋亡或壞死時(shí),細(xì)胞膜通常會(huì)發(fā)生外翻,此時(shí)用熒光探針FITC標(biāo)記的Annexin V則可以直接檢測(cè)到這一現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,染毒后芥子氣能引起明顯的細(xì)胞凋亡,并呈劑量依賴關(guān)系,在100μM時(shí)約有50%的細(xì)胞發(fā)生凋亡,凋亡結(jié)果與CCK-8檢測(cè)結(jié)果相一致。二乙烯砜細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在0~25μM范圍內(nèi),細(xì)胞凋亡率隨著染毒劑量的增加逐漸增加,但是從25μM至50μM時(shí)細(xì)胞凋亡率出現(xiàn)了下降,然后從50~400μM時(shí),細(xì)胞凋亡率又逐漸上升,試驗(yàn)結(jié)果與CCK-8細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果相吻合。分析原因可能是因?yàn)锳nnexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒主要是通過(guò)細(xì)胞膜外翻以及細(xì)胞膜破裂來(lái)進(jìn)行熒光染色,根據(jù)前面試驗(yàn)結(jié)果顯示,在0~25μM范圍內(nèi),二乙烯砜可能引起細(xì)胞膜的破裂,所以凋亡率逐漸上升。但在50μM時(shí),鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞還保持著較為完整的細(xì)胞形態(tài),所以凋亡率出現(xiàn)了下降。單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)是觀察細(xì)胞DNA斷裂損傷作用的常用方法。結(jié)果顯示,芥子氣與二乙烯砜在低劑量的情況下就能引起明顯的DNA斷裂損傷,隨著染毒劑量的增加,DNA損傷程度逐漸增加,并產(chǎn)生明顯的彗星拖尾現(xiàn)象。同時(shí),在相同劑量時(shí),芥子氣引起的損傷作用明顯大于二乙烯砜引起的損傷作用。結(jié)果表明,芥子氣與二乙烯砜均能引起DNA的斷裂損傷,具有一定的遺傳毒性。熒光定量PCR檢測(cè)DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,芥子氣染毒24小時(shí)后,DNA損傷修復(fù)基因均有不同程度的升高,RAD51和ABH3增加最為明顯,分別提高了約6倍和5倍,其他基因增加都不超過(guò)3倍。12小時(shí)時(shí),基因也有不同程度的增加,增加幅度小于24小時(shí)。而在6小時(shí)時(shí),基因表達(dá)基本沒(méi)有變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明芥子氣引起的DNA損傷可能主要由直接移除修復(fù)和同源重組修復(fù)兩種方式進(jìn)行修復(fù)。二乙烯砜實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,染毒24小時(shí)后,DNA損傷修復(fù)基因表達(dá)出現(xiàn)了明顯的下降,12小時(shí)也出現(xiàn)了下降,但6小時(shí)基本沒(méi)有變化。分析原因可能是因?yàn)榻孀託馀c二乙烯砜和DNA相互作用的毒性原理不同,芥子氣的毒性作用原理是取代反應(yīng),脫去氯,與DNA親核位點(diǎn)結(jié)合,生成各種水解產(chǎn)物;二乙烯砜主要是發(fā)生加成反應(yīng),雙鍵斷裂,與物質(zhì)結(jié)合,生成各種產(chǎn)物。γH2AX、PARP和p53是細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白,在DNA損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在本研究中,采用Western blot檢測(cè)這些蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,芥子氣染毒24小時(shí)后,隨著染毒劑量的增加,γH2AX蛋白表達(dá)量有略微增加,PARP 116k D整體蛋白表達(dá)呈逐漸降低的趨勢(shì),p53和磷酸化p53呈先升高后降低的趨勢(shì)。說(shuō)明在芥子氣引起DNA損傷后,在低劑量范圍內(nèi),p53和PARP主要起修復(fù)作用,促進(jìn)細(xì)胞生存;當(dāng)染毒劑量升高后,細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷,并且難以被修復(fù)時(shí),p53和PARP主要起促凋亡作用,引起細(xì)胞死亡。二乙烯砜染毒24小時(shí)后,γH2AX和PARP蛋白表達(dá)量基本沒(méi)有變化,p53蛋白隨著劑量的增加先升高后降低,而磷酸化p53則沒(méi)有檢測(cè)到。細(xì)胞DNA損傷修復(fù)過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的通路體系,是由多種蛋白、多條通路共同作用的結(jié)果,所以要想完全揭示芥子氣與二乙烯砜DNA損傷修復(fù)過(guò)程還需進(jìn)一步的深入研究。結(jié)論通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究,我們得出以下結(jié)論:芥子氣與二乙烯砜對(duì)Haca T細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性作用,能夠引起細(xì)胞凋亡;二乙烯砜的細(xì)胞毒性作用大于芥子氣。芥子氣與二乙烯砜都具有一定的遺傳毒性,能引起DNA的斷裂損傷,芥子氣的DNA毒性作用大于二乙烯砜。芥子氣引起的Haca T細(xì)胞DNA損傷可能主要由同源重組修復(fù)和直接移除修復(fù)兩種方式進(jìn)行修復(fù),而二乙烯砜相關(guān)修復(fù)基因的表達(dá)量卻是不斷降低。γH2AX、PARP和p53參與了芥子氣引起的DNA損傷修復(fù)過(guò)程,而二乙烯砜沒(méi)有觀察到明顯的變化。
[Abstract]:Mustard gas is a kind of chemical warfare agent which has a long history and can cause erosive toxicity damage . After the first use in Germany in 1917 , various kinds of metabolic products were found . The results showed that the cell survival rate decreased gradually with the increase of the concentration of dye . The results showed that the cell survival rate decreased gradually with the increase of the concentration of the virus . The results showed that the cell viability was decreased gradually with the increase of the concentration of the virus . The results showed that the apoptosis rate increased with the increase of cell membrane stability in the range of 0 锝，

本文編號(hào)：1713641