本文關(guān)鍵詞： 放射敏感/抗拒模型 TRF2 放射敏感性 RNAi干擾 TRF2 放射敏感性 端粒酶活性 端粒長(zhǎng)度　出處：《武漢大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：通過X射線反復(fù)輻射端粒酶陽(yáng)性的人肺腺癌細(xì)胞株A549和端粒酶陰性的人骨肉瘤細(xì)胞株U20S,篩選出具有輻射耐受的細(xì)胞株A549R和U20SR,建立具有放射敏感性差異的對(duì)比模型,為研究放射敏感性提供具有相同起源和相似遺傳背景的細(xì)胞模型。通過比較放射敏感株與抗拒株間端粒重復(fù)序列結(jié)合因子2(Telomere Repeat Sequences Factor2, TRF2)的表達(dá)水平的差異,為研究RNA干擾TRF2對(duì)腫瘤細(xì)胞放射敏感性的影響奠定理論依據(jù)。 方法：將指數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞和U20S細(xì)胞用6Mv的X線在室溫條件下按照單次200cGy的劑量進(jìn)行照射(射野35cmx35cm,源皮距100cm,X線治療機(jī)),重復(fù)照射32次。照射完畢后,將細(xì)胞傳代達(dá)到穩(wěn)定,采用克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行放射敏感性測(cè)定。具有放射抗拒性的A549R細(xì)胞系和U2OSR細(xì)胞系篩選完成后,采用RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)TRF2在放射敏感／抗拒模型A549/A549R和U2OS/U2OSR中的基因和蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果：經(jīng)過64GyX線照射后,A549細(xì)胞和U20S細(xì)胞的放射抗拒性增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。其中,A549的D0=2.911±0.019, SF2=0.6254±0.041, A549R的D0=4.316±0.008, SF2=0.7813±0.014；U2OS的Do=2.851±0.012,SF2=0.54590.009,U20SR的Do=3.846±0.007,SF2=0.7081±0.013。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,TRF2在放射抗拒株A549R和U2OSR中的基因和蛋白表達(dá)水平均比放射敏感株A549和U20S增高(P0.05)。 結(jié)論：腫瘤細(xì)胞的放射敏感性經(jīng)重復(fù)的6MvX射線照射后明顯降低,并在傳代過程中持續(xù)存在。64Gy的X線照射聯(lián)合傳代培養(yǎng)可以成功篩選放射抗拒株,構(gòu)建具有相同組織來源和相似遺傳背景的放射敏感／抗拒模型,為研究端粒結(jié)合蛋白TRF2與腫瘤細(xì)胞放射敏感性的關(guān)系提供了良好的模型。放射抗拒株TRF2基因和蛋白表達(dá)水平的升高,為進(jìn)一步研究RNA干擾TRF2基因?qū)δ[瘤細(xì)胞放射敏感性的影響奠定了理論基礎(chǔ)。 目的：通過構(gòu)建FAM-TRF2-siRNA干擾序列,并轉(zhuǎn)染至端粒酶陽(yáng)性的人肺腺癌細(xì)胞A549和端粒酶陰性的人骨肉瘤細(xì)胞U20S中,聯(lián)合不同劑量X射線照射,觀察處理后腫瘤細(xì)胞放射敏感性變化,從而研究TRF2基因在放射增敏中的作用。 方法：根據(jù)TRF2mRNA編碼序列設(shè)計(jì)針對(duì)TRF2的特異性siRNA干擾序列,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至A549和U20S細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后提取RNA及蛋白,分別通過RT-PCR、Western Blot檢測(cè)干擾前后TRF2在基因水平及蛋白水平的表達(dá)。利用克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察干擾TRF2前后A549和U20S細(xì)胞放射敏感性有無變化。通過端粒重復(fù)序列擴(kuò)增方法(TRAP-PCR-ELISA)和QPCR法檢測(cè)干擾TRF2前后A549和U20S細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度以及A549細(xì)胞的端粒酶活性有無變化。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)干擾TRF2前后A549和U20S細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況。 結(jié)果：A549和U20S細(xì)胞經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后,在顯微鏡下可以觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)及細(xì)胞病變效應(yīng)。RT-PCR和Western Blot檢測(cè)TRF2在A549和U20S中的mRNA表達(dá)抑制率為分別為89%和85%,蛋白表達(dá)抑制率為分別為75%和48%,這表明FAM-TRF2-siRNA干擾序列可以在一定程度上降低TRF2的基因和蛋白表達(dá)水平,獲得TRF2蛋白表達(dá)缺陷的細(xì)胞模型。QPCR法顯示,A549組、A549-R組、A549-siTRF2組、A549-siTRF2-R組中反應(yīng)端粒長(zhǎng)度的T/S值分別為2.02±0.08、2.42±0.04、1.57±0.16、1.89±0.138。A549-R組的端粒長(zhǎng)度較A549-NC組細(xì)胞延長(zhǎng)(P0.05),A549-siTRF2組的端粒長(zhǎng)度較A549-NC組細(xì)胞縮短(P0.05),A549-siTRF2-R的端粒長(zhǎng)度較A549-NC組細(xì)胞縮短(P0.05),較A549-siTRF2組細(xì)胞延長(zhǎng)(P0.05),較A549-R組細(xì)胞縮短(P0.05)。U20S組、U2OS-R組、U2OS-siTRF2組、U2OS-siTRF2-R組中反應(yīng)端粒長(zhǎng)度的T/S值分別為3.64±0.18、3.00±0.33、2.77±0.12、2.04±0.10。U2OS-R組的端粒長(zhǎng)度較U2OS-NC組細(xì)胞縮短(P0.05),U2OS-siTRF2組的端粒長(zhǎng)度較U2OS-NC組細(xì)胞縮短(P0.05),U2OS-siTRF2-R組較U2OS-NC組、U2OS-R組、U2OS-siTRF2組細(xì)胞端粒長(zhǎng)度均縮短(P0.05)。TRAP-PCR-ELISA法顯示：經(jīng)FAM-TRF2-siRNA序列干擾后,A549細(xì)胞端粒酶活性從干擾前的2.35544±0.1003減低為1.6960±±0.3071(P0.05),活性有所降低。流式細(xì)胞儀檢測(cè)A549細(xì)胞系和U20S細(xì)胞系接受FAM-TRF2-siRNA序列干擾前后的細(xì)胞周期結(jié)果顯示：A549-R組G0/G1期細(xì)胞比例升高,S期細(xì)胞比例降低；A549-siTRF2-R的S期細(xì)胞比例降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；與U20S相比,U20S-R, U2OS-siTRF2、U2OS-siTRF-R組G0/G1期細(xì)胞降低、S期和G2/M期均增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫熒光檢測(cè)A549細(xì)胞系和U20S細(xì)胞系接受FAM-TRF2-siRNA序列干擾前后γH2AX的表達(dá),結(jié)果顯示,A549細(xì)胞系和U20S細(xì)胞系接受FAM-TRF2-siRNA序列干擾后,γH2AX的表達(dá)增多。 結(jié)論：成功構(gòu)建了具有干擾腫瘤細(xì)胞TRF2mRNA基因的干擾序列FAM-TRF2-siRNA。該序列能抑制TRF2基因和蛋白表達(dá),為進(jìn)一步分析TRF2影響腫瘤細(xì)胞放射敏感性的具體機(jī)制提供TRF2表達(dá)缺陷模型。FAM-TRF2-siRNA可以顯著降低腫瘤細(xì)胞放射敏感性,使DNA損傷增加,端�？s短,影響細(xì)胞周期分布,同時(shí)端粒酶陽(yáng)性細(xì)胞的端粒酶活性有所降低。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R730.55

【參考文獻(xiàn)】

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1 魏?jiǎn)⒋?鄭樹;放射抗拒肺癌細(xì)胞亞系D6-R的建立及其細(xì)胞周期研究[J];中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志;2003年04期

2 李志強(qiáng);夏云飛;柳青;劉秀芳;韓非;易煒;羅偉;盧泰祥;;鼻咽癌放射治療分型的臨床研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2006年46期

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本文編號(hào)：1456811