本文關(guān)鍵詞： 骨軟骨 異體移植 液體培養(yǎng) 體外保存　出處：《泰山醫(yī)學(xué)院》2012年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的 通過對4℃和37℃溫度條件以及保存過程中是否更換培養(yǎng)液對軟骨細(xì)胞活性影響的比較選出適合液體培養(yǎng)保存骨軟骨組織的溫度和液體處理條件。再觀察加入了EGCG與IGF-Ⅰ的培養(yǎng)液對細(xì)胞活性的影響，以探索培養(yǎng)液的有效成份，為進(jìn)一步尋找最佳的培養(yǎng)液提供指導(dǎo)。 材料與方法 本實驗分兩部分。 第一部分:不同保存溫度及換液與否的比較。 以羊踝關(guān)節(jié)軟骨為實驗材料，將獲取的同樣大小的踝關(guān)節(jié)骨軟骨塊120枚經(jīng)過無菌PBS液沖洗后隨機(jī)分配到4組相同的無菌培養(yǎng)瓶中，分別向這四組瓶中加入相同的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，成份為89%EMEM培養(yǎng)液、10%胎牛血清（FBS）和1%的青鏈霉素（各100UI/ml），標(biāo)準(zhǔn)為沒過組織塊0.5cm。根據(jù)保存方式的不同將其分為A、B、C、D四個組，其中A組保存于4℃冰箱中，每隔兩天換液一次；B組保存于4℃冰箱中，保存全程不換液；C組保存于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，每隔兩天換液一次；D組保存于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，，保存全程不換液。分別于保存第7、21、35天每組取出10塊進(jìn)行檢測，檢測項目包括EB/FDA雙熒光法測細(xì)胞存活率、HE、番紅-O染色，觀察并比較各組之間在不同時間點細(xì)胞存活率和活性的區(qū)別。 第二部分: EGCG、IGF-Ⅰ及其共同作用對液體保存骨軟骨組織的影響。 同樣以羊踝關(guān)節(jié)軟骨為實驗材料，取180枚骨軟骨塊經(jīng)過與上一步同樣的處理后隨機(jī)分配到4組相同的無菌培養(yǎng)瓶中，并根據(jù)培養(yǎng)液成份的不同將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個組，其中Ⅰ組培養(yǎng)液成份為與第一部分實驗相同的基礎(chǔ)培養(yǎng)液；Ⅱ組為基礎(chǔ)培養(yǎng)液加100ng/ml的IGF-Ⅰ；Ⅲ組為基礎(chǔ)培養(yǎng)液加0.01mmol/L的EGCG；Ⅳ組為基礎(chǔ)培養(yǎng)液同時加入100ng/ml的IGF-Ⅰ和0.01mmol/L的EGCG。將這四組培養(yǎng)瓶保存于第一步得出的最佳溫度與液體處理條件中。分別檢測新鮮、7天、21天、42天、56天之后組織細(xì)胞的存活率、HE、番紅-O染色及Ⅱ型膠原SABC-FITC免疫熒光染色。分析各組保存效果。 結(jié)果 第一部分，除保存7天時溫度因素，以及溫度與液體處理兩因素交互作用對細(xì)胞存活率沒有影響之外，其余各時間點的溫度因素、液體處理因素及溫度與液體處理兩因素交互作用都對細(xì)胞存活率的變化產(chǎn)生了影響，其中保存7天、21天、35天時細(xì)胞存活率最高值分別為90.88±3.69%、88.31±3.93%、78.69±8.56%，均出現(xiàn)在4℃條件下?lián)Q液保存組。對各組番紅-O的分析除了保存7天時A組IOD值明顯高于其他三組外，其他保存時間點IOD值組間比較無顯著差異。各組保存效果隨著時間的延長出現(xiàn)了明顯的下降趨勢，且下降速率從保存21天起迅速增加。因此，4℃條件下?lián)Q液保存法保存骨軟骨組織效果比37℃、不換液效果好。 第二部分，保存7天時，基礎(chǔ)培養(yǎng)液組（Ⅰ）、基礎(chǔ)培養(yǎng)液+IGF-Ⅰ組（Ⅱ）、基礎(chǔ)培養(yǎng)液+EGCG組（Ⅲ）細(xì)胞存活率組間無明顯差別，均從新鮮的87.45±3.59%降至81%左右，基礎(chǔ)培養(yǎng)液+EGCG+IGF-Ⅰ組（Ⅳ）為63.72±12.42%，出現(xiàn)明顯下降；保存21天時，后二組細(xì)胞存活率下降明顯,分別低至70.17±3.88%和64.69±5.63%，明顯低于前兩組的78.58±3.10%和80.41±3.87%；保存42天和56天時，各組各檢測指標(biāo)均出現(xiàn)大幅下降，降至20%左右，組間差別不大，已無分析意義。對番紅-O染色和Ⅱ型膠原染色也表現(xiàn)出了相同的差別與變化趨勢。各組保存效果隨著時間的延長出現(xiàn)了明顯的下降趨勢，且下降速率從保存21天起迅速增加。因此，培養(yǎng)液中加入100ng/ml的IGF-Ⅰ沒有對體外培養(yǎng)保存骨軟骨組織的效果產(chǎn)生有益的作用，加入0.01mmol/L的EGCG和兩種因子同時加入對保存效果產(chǎn)生了有害作用。 結(jié)論 1、采用4℃條件下保存、每隔2天進(jìn)行一次換液的處理方式體外液體培養(yǎng)保存骨軟骨組織效果比37℃、不換液的方式好； 2、培養(yǎng)液中加入100ng/ml的IGF-Ⅰ沒有對體外培養(yǎng)保存骨軟骨組織的效果產(chǎn)生有益的作用，加入0.01mmol/L的EGCG和兩種因子同時加入對保存效果產(chǎn)生了有害作用。 意義 關(guān)節(jié)軟骨全層損傷的治療對骨科和運(yùn)動醫(yī)學(xué)醫(yī)生一直是一個難題。異體骨軟骨移植治療較大的全層軟骨損傷成為一個有前途的方法。但是由于供體來源有限和移植物微生物學(xué)的檢測，如何長時間的保存有活性的軟骨移植物成為研究者關(guān)注的焦點。本實驗通過比較不同溫度和不同換液條件對液體培養(yǎng)法保存骨軟骨組織的效果，選出了一種較為理想的保存溫度和液體處理條件，又以這種條件為基礎(chǔ)，觀察了EGCG與IGF-Ⅰ這兩種對液體培養(yǎng)保存軟骨有益的成份同時作用對骨軟骨組織的影響。為進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)培養(yǎng)液的成份做出了指導(dǎo)。
[Abstract]:objective
Through the comparison of select whether to replace the effect of culture medium on cartilage cell activity of 4 degrees and 37 degrees temperature conditions and the preservation of culture temperature and liquid processing conditions of preservation of osteochondral tissue for liquid. Again observed the addition effect of medium EGCG and IGF- I on cell activity, in order to explore the cultivation of effective ingredients of liquid. Provide guidance for further searching for the best medium.
Materials and methods
This experiment is divided into two parts.
The first part: the comparison of the different preservation temperature and the change of the liquid.
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本文編號：1455313