本文關(guān)鍵詞： 阿霉素 超順磁性氧化鐵 超聲造影劑 多功能 多功能造影劑 超聲 染料 淋巴結(jié) 巨噬細(xì)胞 阿霉素 超順磁性 超聲造影劑 多功能 轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的分別制備兩種多功能超聲造影劑：載染料蘇丹黑B的聚乳酸羥基乙酸超聲微泡造影劑（SB-PLGA）和載阿霉素的超順磁性聚乳酸羥基乙酸超聲微泡造影劑（DOX-SPLGA），并檢測其一般特性。 方法采用雙乳化法和真空冷凍干燥法分別制備出SB-PLGA及不同鐵濃度的DOX-SPLGA,并對其進行粒徑，形態(tài)，包封率等性質(zhì)檢測；其中對載藥微泡DOX-SPLGA還進行了體外釋藥實驗觀察，采用原子吸收分光光度計檢測造影劑的鐵含量；用振動樣品磁強計及磁共振儀檢測造影劑的磁學(xué)性質(zhì)；體外超聲和磁共振顯像評價造影劑的顯像效果。 結(jié)果SB-PLGA外觀呈蓬松的藍(lán)色粉末狀，溶于水后為均勻的深藍(lán)色乳液，分散度好。掃描電鏡觀察微泡粒徑1～2μm，其形態(tài)規(guī)則，呈球形，表面光滑，大小均勻。馬爾文電位檢測其Zeta電位為（20.80±1.60）mV，SB的包封率為（85.67±1.44）%，載藥量為（3.43±0.06）%，分散度好。DOX-SPLGA外觀呈黃褐色粉末，溶于水后為均勻的乳液，分散度較好。掃描電鏡觀察微泡呈球形，表面有孔，大小較均勻，透射電鏡顯示微泡為殼核結(jié)構(gòu)，SPIO納米顆粒分布于微泡的殼膜中。原子吸收光譜法得到7種不同鐵濃度制得的DOX-SPLGA中的鐵含量分別為（1.47±0.07）μg/ml（,2.83±0.08）μg/ml,（5.76±0.33）μg/ml（,14.77±0.32）μg/ml,（28.06±0.62）μg/ml，（56.71±0.44）μg/ml，（185.45±1.06）μg/ml，其相對應(yīng)的DOX的包封率分別為（58.10±1.61）%（,57.73±3.45）%,（60.30±2.67）%,（57.53±0.80）%,（61.13±0.95）%,（56.07±1.55）%,（59.60±1.61）%；DOX的載藥量分別為（5.81±0.16）%,（5.77±0.35）%,（6.03±0.27）%,（5.75±0.08）%,（6.11±0.10）%,（5.61±0.16）%,（5.96±0.16）%。造影劑的粒徑為800~900nm，具有超順磁性，其磁敏感效應(yīng)與殼膜中裝載的SPIO的含量有關(guān)。體外超聲顯像實驗顯示，DOX-SPLGA能夠較普通PLGA造影劑產(chǎn)生更強的超聲回聲。體外磁共振顯像實驗顯示，T2*信號隨著造影劑內(nèi)鐵濃度的增高而降低。 結(jié)論SB-PLGA造影劑為藍(lán)色粉末，粒徑均勻，分散好，為其之后既能外科手術(shù)前進行腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)內(nèi)超聲顯像，又能手術(shù)活檢時指示定位淋巴結(jié)提供了基礎(chǔ)。DOX-SPLGA造影劑具有形態(tài)規(guī)則,大小較均一，表面光滑有孔，分散均勻,超順磁性等優(yōu)點，在體外能夠增強超聲、磁共振顯像，同時能載藥輔助化療，是一種有應(yīng)用前景的多功能超聲造影劑。 目的探討SB-PLGA造影劑的細(xì)胞毒性及被巨噬細(xì)胞吞噬的能力；探討SB-PLGA造影劑對兔腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的超聲顯像和手術(shù)示蹤效果，及其在淋巴結(jié)組織內(nèi)的分布情況。 方法體外培養(yǎng)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7，加入同一濃度SB-PLGA造影劑孵育3h、24h和48h后，光鏡下觀察巨噬細(xì)胞對造影劑的吞噬情況，用MTT法檢測造影劑對巨噬細(xì)胞增殖活性的影響。采用瘤塊組織懸液種植法建立兔VX2乆窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)模型，建模后14天用于腫瘤淋巴結(jié)超聲顯像。選取腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)模型兔8只，共16個腫瘤淋巴結(jié)（實驗組8個，對照組8個），實驗組給予SB-PLGA造影劑，，對照組給予等量生理鹽水，分別經(jīng)足墊皮下間隙注射，行超聲造影檢查評價乆窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)及第二站腹股溝淋巴結(jié)的增強效果；并分別于30min后行乆窩和腹股溝淋巴結(jié)清掃術(shù)，切除藍(lán)染及未染色淋巴結(jié)，進行冰凍切片HE染色。 結(jié)果光鏡下觀察，巨噬細(xì)胞對SB-PLGA造影劑的吞噬量隨著造影劑與細(xì)胞孵育時間的增加而增加。MTT結(jié)果顯示，SB-PLGA造影劑被巨噬細(xì)胞吞噬后對其增殖活性無明顯影響。超聲造影可明顯增強兔乆窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)顯像，而同側(cè)腹股溝淋巴結(jié)及注射生理鹽水組顯像不明顯。乆窩淋巴結(jié)清掃術(shù)中可見，注射SB-PLGA造影劑組淋巴結(jié)染色效果好；而腹股溝淋巴結(jié)清掃術(shù)中均未見第二站淋巴結(jié)藍(lán)染。淋巴結(jié)冰凍切片HE染色可見，SB-PLGA存在于淋巴竇內(nèi)，并有大量進入巨噬細(xì)胞。 結(jié)論SB-PLGA在體外能夠被巨噬細(xì)胞吞噬，且對細(xì)胞增殖活性無明顯影響。SB-PLGA能夠被淋巴結(jié)內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬，增強淋巴結(jié)超聲顯像，同時又能通過染色來指示定位淋巴結(jié)，是一種良好的多功能超聲造影劑。 目的探討DOX-SPLGA造影劑對兔腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的超聲和磁共振顯像效果；探討DOX-SPLGA造影劑聯(lián)合低頻超聲促進藥物釋放對兔腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的治療效果。 方法新西蘭大白兔42只，采用瘤塊種植法于大腿外側(cè)植入VX2腫瘤組織塊懸液，建立兔乆窩腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)模型。建模后第15天，取12只模型兔（24個腫瘤淋巴結(jié)），隨機分為三組（每組8個腫瘤淋巴結(jié)），分別為DOX-SPLGA組（經(jīng)足墊皮下注射DOX-SPLGA微泡）、PLGA組（經(jīng)足墊皮下注射普通PLGA微泡）及對照組（經(jīng)足墊皮下注射等量生理鹽水），行超聲和磁共振掃描，并應(yīng)用圖像分析軟件評價造影效果。掃描結(jié)束后，取淋巴結(jié)組織進行HE染色和普魯士藍(lán)染色，以及透射電鏡檢查。建模后第15天，取30只模型兔（60個腫瘤淋巴結(jié)），隨機分為6組（每組10個腫瘤淋巴結(jié)），包括空白對照組（C）、載藥微泡（DOX-SPLGA）、單純藥物組（DOX）、單純微泡+超聲組（PLGA+US）、藥物+超聲組（DOX+US）、載藥微泡+超聲組（DOX-SPLGA+US）。治療后取腫瘤淋巴結(jié)組織，用免疫組化法檢測淋巴結(jié)組織PCNA、CD34及LYVE-1的表達；TUNEL法檢測淋巴結(jié)內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡。 結(jié)果在超聲顯像的造影模式和傳統(tǒng)灰階模式下，與對照組相比，經(jīng)DOX-SPLGA與普通PLGA微泡造影后，乆窩淋巴結(jié)均可見回聲增強；且DOX-SPLGA組比普通PLGA組回聲更強。在磁共振顯像中，DOX-SPLGA組表現(xiàn)出明顯負(fù)性增強效果，普通PLGA組負(fù)性增強效果較弱，而對照組未見明顯增強。普魯士藍(lán)染色和透射電鏡結(jié)果均證實了DOX-SPLGA存在于淋巴結(jié)組織內(nèi)。免疫組化結(jié)果顯示，DOX-SPLGA+US組的凋亡指數(shù)（AI）顯著高于其它各組（P0.05）；DOX-SPLGA+US組的腫瘤增殖受到明顯抑制，其增殖指數(shù)明顯低于其它各組（P0.05）。 結(jié)論DOX-SPLGA造影劑能顯著增強顯像超聲和磁共振兩種模式下的兔腫瘤轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，同時聯(lián)合低頻超聲促進造影劑內(nèi)的藥物釋放，達到治療轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的效果，為尋求一種有效、安全、集顯像和治療
[Abstract]:Objective To prepare two kinds of multi - functional ultrasound contrast agents : the ultrasonic microbubble contrast agent ( SB - PLGA ) of poly ( lactic acid glycolic acid ) and the super - paramagnetic polylactic acid hydroxyacetic acid ultrasonic microbubble contrast agent ( GSPLGA ) loaded with adriamycin . Methods SB - PLGA and different iron concentrations were prepared by double emulsion method and vacuum freeze - drying method . The particle size , morphology , encapsulation efficiency and so on were tested . The magnetic properties of contrast agent were determined by using atomic absorption spectrophotometer . The magnetic properties of contrast agent were detected by vibrating sample magnetometer and magnetic resonance instrument , and the imaging effect of contrast agent was evaluated in vitro and magnetic resonance imaging . Results SB - PLGA appeared in a fluffy blue powder form , which was dissolved in water to form a homogeneous deep blue emulsion with good dispersion . The microvesicles were observed by scanning electron microscope . The entrapment efficiency of the microvesicles was ( 20.80 鹵 1.60 ) mV , ( 5.76 鹵 0 . 33 ) 渭g / ml , ( 56.71 鹵 0 . 44 ) 渭g / ml , ( 57.53 鹵 0 . 80 ) % , ( 61.13 鹵 0.95 ) % , ( 56.07 鹵 1.55 ) % , ( 59.60 鹵 1 . 61 ) % , respectively . The particle size of the contrast medium was 800 - 900nm , ( 5.61 鹵 0.16 ) % , ( 5.96 鹵 0.16 ) % , ( 5.61 鹵 0.16 ) % , ( 5.96 鹵 0.16 ) % . Conclusion The SB - PLGA contrast agent is a blue powder with uniform particle size and good dispersion . It has the advantages of regular morphology , uniform size , smooth surface , uniform distribution , super paramagnetism and so on . Objective To investigate the cytotoxicity of SB - PLGA contrast agent and the ability of macrophages to phagocytize the tumor , and to investigate the ultrasound imaging and surgical tracing effect of SB - PLGA contrast agent on the metastatic lymph node of rabbit tumor and its distribution in lymph node tissue . Methods Mouse mononuclear phagocytes RAW264.7 were cultured in vitro and incubated for 3 h , 24 h and 48 h with the same concentration of SB - PLGA contrast medium . The effect of contrast agent on the proliferation of macrophages was observed by MTT assay . Results The results showed that SB - PLGA contrast medium had no significant effect on the proliferation of SB - PLGA contrast medium . The results showed that SB - PLGA contrast media had no obvious effect on the proliferation activity of lymph node and injected physiological saline group . Conclusion SB - PLGA can be phagocytosed by macrophages in vitro and has no significant effect on cell proliferation activity . SB - PLGA can be phagocytosed by macrophages in lymph nodes , enhanced lymph node ultrasound imaging , and can be used to indicate the localization of lymph nodes by staining , which is a good multi - functional ultrasound contrast agent . Objective To investigate the ultrasound and magnetic resonance imaging of tumor metastasis lymph nodes in rabbits by using the contrast medium - SPLGA contrast agent , and to investigate the effect of the combination of the combined low - frequency ultrasound in the treatment of tumor metastasis lymph nodes in rabbits . Methods 42 model rabbits ( 24 tumor nodes ) were randomly divided into three groups ( 10 tumor nodes in each group ) , including blank control group ( C ) , drug - loaded microvesicle ( PLGA + US ) , drug + ultrasound group , drug + ultrasound group and drug - carrying microbubble + ultrasound group . The expression of PCNA , CD34 and LYVE - 1 in lymph nodes was detected by immunohistochemistry . Results Compared with the control group , the echogenic enhancement was observed in the lymph nodes of the common PLGA group compared with the control group . In the magnetic resonance imaging , there was a significant negative enhancement effect on the lymph nodes of the common PLGA group . The results of both blue staining and transmission electron microscopy showed that the apoptosis index ( AI ) of the common PLGA group was significantly higher than that in the other groups ( P0.05 ) . Conclusion The contrast agent can significantly enhance the metastatic lymph nodes of rabbit tumors in both the imaging and magnetic resonance modes . Meanwhile , the combination of low frequency ultrasound can promote the drug release in contrast agent , so as to achieve the effect of treating metastatic lymph node , and to seek an effective , safe , set imaging and treatment .

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R730.55

【參考文獻】

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本文編號：1450906