本文關(guān)鍵詞：血管生長(zhǎng)因子及其受體-2在顱咽管瘤放療敏感性中的作用研究　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景顱咽管瘤(craniopharyngioma)是一種先天性的組織學(xué)上表現(xiàn)為良性但具有侵襲性和侵潤(rùn)性的鞍區(qū)上皮性腫瘤,其治療以手術(shù)切除為主,但由于腫瘤周?chē)鷱?fù)雜而重要的解剖關(guān)系(如視神經(jīng),視交叉,垂體柄,頸內(nèi)動(dòng)脈,垂體,丘腦下部等)和腫瘤本身因素(如部位、鈣化、范圍、粘連等),手術(shù)全切除率僅為18-84%,術(shù)后嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生率較高,術(shù)后死亡率高達(dá)1.7-5.4%。而且術(shù)后復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)期垂體和視丘下部功能障礙也是困擾神經(jīng)外科多年的難題。復(fù)發(fā)性顱咽管瘤的治療難度則明顯增大,不僅手術(shù)全切除率明顯下降,而且圍手術(shù)期的死亡率和致殘率也明顯上升。作為一種良性腫瘤,目前手術(shù)治療的總體結(jié)果并不能令人滿(mǎn)意。放射治療,包括普通分次外放療、立體定向放射外科治療和腫瘤內(nèi)放射性同位素間質(zhì)內(nèi)放療,作為單獨(dú)的或輔助的顱咽管瘤治療措施,已顯示出明顯的治療效果。同時(shí),顱咽管瘤對(duì)放射治療的敏感性也得到廣泛的臨床證實(shí)和學(xué)者們的認(rèn)可。立體定向間質(zhì)內(nèi)放療作為輔助治療可明顯減少手術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)率和復(fù)發(fā)時(shí)間。但與其它腫瘤一樣,顱咽管瘤的放射治療也存在局限性,如較高的放射性副損傷的發(fā)生率限制了放射劑量,而腫瘤對(duì)放射治療敏感性的差異,使腫瘤控制率難以達(dá)到令人滿(mǎn)意的水平。已有研究表明在許多腫瘤(如肺癌,肝癌、乳腺癌和子宮癌)中血管生成能促進(jìn)腫瘤的氧合、營(yíng)養(yǎng)灌注,并清除腫瘤的代謝廢物,在腫瘤的生長(zhǎng)過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用,同時(shí)也是腫瘤對(duì)放射治療抵抗的一個(gè)關(guān)鍵因素。血管生成是內(nèi)皮細(xì)胞增殖刺激和抑制因素之間的一個(gè)微妙的平衡結(jié)果。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是最重要的血管生成誘發(fā)因素,其受體(VEGFR)主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá),介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分裂并對(duì)血管通透性產(chǎn)生影響。VEGF家族成員功能的發(fā)揮需要與細(xì)胞表面的具有酪氨酸激酶活性的VEGFR的結(jié)合來(lái)介導(dǎo),VEGFR分為VEGFR-1和VEGFR-2兩種亞型,其中VEGFR-2幾乎介導(dǎo)了全部VEGF的細(xì)胞功能。研究發(fā)現(xiàn)VEGF及其受體在多種惡性腦腫瘤(膠質(zhì)細(xì)胞瘤,血管母細(xì)胞瘤和腦膜瘤)中的表達(dá)明顯強(qiáng)于正常腦組織,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)VEGF及其受體的過(guò)表達(dá)不僅可以導(dǎo)致血管生成,還可激發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖。已有研究證明,在顱咽管瘤中存在β-catenin介導(dǎo)的VEGF/VEGFR的表達(dá)異常,而且在釉質(zhì)型顱咽管瘤的表達(dá)明顯高于鱗狀乳頭型,在復(fù)發(fā)顱咽管瘤的表達(dá)也明顯高于原發(fā)顱咽管瘤。Xia等研究發(fā)現(xiàn)VEGF主要表達(dá)于釉質(zhì)型顱咽管瘤腫瘤細(xì)胞巢的細(xì)胞質(zhì)和基質(zhì)中,而且在復(fù)發(fā)腫瘤中的表達(dá)明顯高于原發(fā)腫瘤,說(shuō)明VEGF在腫瘤的侵襲性生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)中起到至關(guān)重要的作用。Vidal等的研究表明,VEGFR-2的mRNA不僅在間質(zhì)毛細(xì)血管表達(dá),同時(shí)也表達(dá)于顱咽管瘤上皮成分。這些研究表明VEGFR-2在血管內(nèi)皮細(xì)胞和非血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)均發(fā)揮了的重要調(diào)節(jié)作用。我們?cè)谂R床工作中發(fā)現(xiàn),顱咽管瘤病人對(duì)間質(zhì)內(nèi)放療存在很大的放射敏感差異。已有研究主要集中在VEGF/VEGFR-2與顱咽管瘤復(fù)發(fā)的研究,而對(duì)VEGF/VEGFR-2和顱咽管瘤的放射治療敏感性的研究卻鮮有報(bào)道。那么VEGF/VEGFR在顱咽管瘤放射抵抗中起著怎樣的作用,其作用機(jī)制又是什么,這些問(wèn)題都需要我們進(jìn)一步探究。為此,本課題首先通過(guò)免疫組織化學(xué)方法對(duì)不同放射敏感性的顱咽管瘤手術(shù)切除標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),明確VEGF/VEGFR-2在顱咽管瘤中的表達(dá)和其與顱咽管瘤放療敏感性的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)原代細(xì)胞培養(yǎng)建立顱咽管瘤細(xì)胞系和VEGFR-2過(guò)表達(dá)的體外實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步研究VEGFR-2的表達(dá)在顱咽管瘤放射敏感性中所起的作用,為進(jìn)一步尋找新的顱咽管瘤治療靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。第一部分VEGF/VEGFR-2的表達(dá)與顱咽管瘤放射治療敏感性的關(guān)系目的：探討復(fù)發(fā)顱咽管瘤腫瘤組織中血管生長(zhǎng)因子及其受體-2(VEGF/VEGFR-2)的表達(dá)與32P間質(zhì)內(nèi)放療療效和放射敏感性的關(guān)系。方法：納入2006年1月至2013年12月在我院接受腫瘤內(nèi)32P間質(zhì)內(nèi)放療的術(shù)后復(fù)發(fā)顱咽管瘤病人32例。應(yīng)用免疫組化檢測(cè)放療前顱咽管瘤腫瘤標(biāo)本中的VEGF和VEGFR-2的表達(dá),并結(jié)合臨床資料和術(shù)后隨訪分析二者與放射治療療效和放射敏感性的關(guān)系。結(jié)果：32例復(fù)發(fā)顱咽管瘤經(jīng)32P間質(zhì)內(nèi)放療12個(gè)月后,經(jīng)臨床證實(shí)為放射敏感者9例和不敏感者23例。VEGF多在腫瘤的胞質(zhì)內(nèi)表達(dá),VEGFR-2不僅在毛細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞且在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。VEGF、VEGFR-2在不同放射治療敏感型腫瘤中的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(VEGF:z=-2.194, p=0.028; VEGFR-2:z=-2.382, p=0.017)。其中2例VEGFR-2不表達(dá)者為放射敏感型,6例VEGFR-2重度表達(dá)者均為放射不敏感型。結(jié)論：顱咽管瘤內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR-2 的表達(dá)與32P間質(zhì)內(nèi)放療療效及敏感性有關(guān)。VEGFR-2低表達(dá)甚至不表達(dá)顱咽管瘤患者,對(duì)32P間質(zhì)內(nèi)放療敏感；而VEGFR-2高表達(dá)者,對(duì)32P間質(zhì)內(nèi)放療不敏感。第二部分顱咽管瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定目的：探討有效的顱咽管瘤細(xì)胞系的原代細(xì)胞培養(yǎng)方法,并對(duì)原代培養(yǎng)的顱咽管瘤細(xì)胞的生物特性進(jìn)行鏡下觀察和相關(guān)檢測(cè)。方法：用組織塊胰酶消化法進(jìn)行顱咽管瘤原代細(xì)胞培養(yǎng),分別用機(jī)械刮除法、差速貼壁法、差速消化法對(duì)原代培養(yǎng)的顱咽管瘤細(xì)胞進(jìn)行純化。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及細(xì)胞形態(tài),采用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定原代培養(yǎng)的顱咽管瘤細(xì)胞的純度和上皮性來(lái)源。結(jié)果：本研究共進(jìn)行了顱咽管瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)10次,培養(yǎng)成功且能夠傳代培養(yǎng)的有8例,最少傳代4代,最長(zhǎng)傳代12代；將6例生長(zhǎng)狀態(tài)良好的已傳代2次的顱咽管瘤細(xì)胞進(jìn)行凍存,復(fù)蘇后細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)沒(méi)有發(fā)生太大改變,細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。顱咽管瘤組織塊接種于培養(yǎng)瓶中24小時(shí)后可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞沿著組織塊向四周爬出,貼壁生長(zhǎng),可見(jiàn)細(xì)胞伸展,呈長(zhǎng)梭形細(xì)胞狀。消化、換液,未貼壁的細(xì)胞形態(tài)多為圓形,透亮,體積較大。重新貼壁后,釉質(zhì)上皮型顱咽管瘤細(xì)胞呈“鋪路石”樣排列,透亮且折光性好,細(xì)胞體積較大,形狀呈多邊形,核圓,胞漿豐富。初次接種細(xì)胞增殖較快,一般3-5天融合率可達(dá)80%以上。初次傳代細(xì)胞增殖較快,隨傳代次數(shù)增多,細(xì)胞分裂增殖能力逐漸減弱,傳代間隔時(shí)間逐漸延長(zhǎng)。同時(shí)空泡狀細(xì)胞逐漸增多,細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黑色小顆粒,細(xì)胞漸漸失去分裂增殖能力,呈老化狀態(tài),最終細(xì)胞失去活性凋亡。廣譜角蛋白(pan-CK)在顱咽管瘤細(xì)胞的胞漿中呈陽(yáng)性表達(dá),證明了顱咽管瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中仍然維持上皮性腫瘤的特性。結(jié)論：用組織塊胰酶消化法結(jié)合差速消化法在含血清的DMEM/f12培養(yǎng)基中成功建立狀態(tài)良好的顱咽管瘤有限細(xì)胞系。顱咽管瘤細(xì)胞呈“鋪路石”樣排列,透亮且折光性好,細(xì)胞體積較大,形狀呈多邊形,核圓,胞漿豐富。廣譜角蛋白(pan-CK)在顱咽管瘤細(xì)胞漿中陽(yáng)性表達(dá),證明了顱咽管瘤原代培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中仍然維持上皮來(lái)源特性。顱咽管瘤細(xì)胞系的建立關(guān)鍵在于腫瘤取材,需要獲取足夠量的實(shí)體腫瘤組織,去除囊變、纖維化和鈣化組織。第三部分VEGFR-2過(guò)表達(dá)對(duì)顱咽管瘤細(xì)胞生物功能的影響目的：在前期顱咽管瘤有限細(xì)胞系建立的基礎(chǔ)上,構(gòu)建VEGFR-2腺病毒載體感染顱咽管瘤細(xì)胞,探討VEGFR-2的表達(dá)對(duì)顱咽管瘤細(xì)胞的增殖和放療敏感性的影響。方法：采用VEGFR-2重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染顱咽管瘤細(xì)胞,通過(guò)qPCR 和 Western blot分別從mRNA和蛋白水平上驗(yàn)證VEGFR-2基因表達(dá)是否成功。用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGFR-2過(guò)表達(dá)對(duì)顱咽管瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響。在不同放射強(qiáng)度的X射線下對(duì)Ad-VEGFR-2實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白組進(jìn)行照射,進(jìn)一步驗(yàn)證VEGFR-2的過(guò)表達(dá)對(duì)顱咽管瘤細(xì)胞的放射敏感性的影響。結(jié)果： (1)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率：鏡下觀察顯示轉(zhuǎn)染成功,當(dāng)MOI為150倍時(shí),24h,48h,72h轉(zhuǎn)染效率分別為：30.54±2.15%、80.45±3.37%、85.87±4.32%,其中轉(zhuǎn)染72h和48h的轉(zhuǎn)染效率顯著高于轉(zhuǎn)染24 h(P0.01),綜合考慮后本實(shí)驗(yàn)我們選擇轉(zhuǎn)染48h的細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。(2)轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48h,qRT-PCR方法測(cè)定轉(zhuǎn)染顱咽管瘤細(xì)胞 VEGFR-2的mRNA表達(dá)。與空白對(duì)照組相比,Ad-GFP組細(xì)胞VEGFR-2的mRNA水平無(wú)顯著變化(P0.05),VEGFR-2過(guò)表達(dá)組與Ad-GFP組相比：VEGFR-2的mRNA表達(dá)顯著升高(P0.05),表明VEGFR-2腺病毒轉(zhuǎn)染顱咽管瘤細(xì)胞及VEGFR-2目的基因過(guò)表達(dá)成功。(3)轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)72h, Western Blot方法測(cè)定轉(zhuǎn)染成功后VEGFR-2蛋白表達(dá)。與空白對(duì)照組相比較,Ad-e GFP組的VEGFR-2蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化(P0.05),而與Ad-GFP組相比,Ad-VEGFR-2-GFP組的 VEGFR-2蛋白水平顯著升高(P0.01),進(jìn)一步說(shuō)明VEGFR-2腺病毒轉(zhuǎn)染顱咽管瘤細(xì)胞及VEGFR-2蛋白過(guò)表達(dá)成功。(4)VEGFR-2過(guò)表達(dá)對(duì)顱咽管瘤細(xì)胞體外增殖的影響本實(shí)驗(yàn)采用VEGFR-2腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù),將VEGFR-2目的基因轉(zhuǎn)染顱咽管瘤細(xì)胞達(dá)到VEGFR-2過(guò)表達(dá)水平。采用CCK-8方法觀察Ad.VEGFR-2轉(zhuǎn)染顱咽管瘤細(xì)胞24 h、48h、72h后的生長(zhǎng)增殖情況,并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相和Ad-e GFP組相比較,Ad-VEGFR-2-GFP組的顱咽管瘤細(xì)胞生長(zhǎng)加快。(P=0.0000)。結(jié)果表明VEGFR-2過(guò)表達(dá)有效地促進(jìn)體外顱咽管瘤細(xì)胞的增殖。(5)VEGFR-2過(guò)表達(dá)對(duì)X射線造成顱咽管瘤細(xì)胞調(diào)亡的影響為了闡明VEGFR-2過(guò)表達(dá)對(duì)顱咽管瘤細(xì)胞的放射敏感性的關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)將VEGFR-2腺病毒轉(zhuǎn)染顱咽管瘤細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24h后接受劑量為2Gy,4Gy,6Gy,8Gy的X射線照射,采用Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化。如圖5所示,經(jīng)不同劑量的X射線照射后,空白組和Ad-VEGFR-2組細(xì)胞調(diào)亡率分別為 2Gy (15.8%±0.5% vs.19.4%±0.3%),4Gy (21.7%±0.6% vs.15.6% ±0.3%),6Gy (24.4%±0.5% vs.17.5%±0.2%),8Gy (25.6%±0.4% vs.19.2%±0.6%)。Ad-VEGFR-2組比空白組細(xì)胞調(diào)亡減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。以上結(jié)果表明,VEGFR-2腺病毒轉(zhuǎn)染后VEGFR-2過(guò)表達(dá)顱咽管瘤細(xì)胞對(duì)輻射引起的凋亡減少,VEGFR-2過(guò)表達(dá)提高了顱咽管瘤細(xì)胞的放射抵抗。結(jié)論：在本研究中我們先用qPCR檢測(cè)得了6株培養(yǎng)成功的顱咽管瘤細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性VEGFR-2表達(dá),發(fā)現(xiàn)6株有限顱咽管瘤細(xì)胞系VEGFR-2表達(dá)很低。因此,我們利用重組腺病毒安全高效地向顱咽管瘤細(xì)胞導(dǎo)入VEGFR-2基因,從而建立了VEGFR-2高表達(dá)的顱咽管瘤細(xì)胞新模型。VEGFR-2對(duì)顱咽管瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響研究發(fā)現(xiàn)VEGFR-2高表達(dá)可明顯促進(jìn)顱咽管瘤細(xì)胞的增殖,同時(shí)提高了顱咽管瘤細(xì)胞對(duì)X射線的抵抗作用,從體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了VEGFR-2的表達(dá)與顱咽管瘤細(xì)胞的放療敏感性的關(guān)系。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R739.4;R730.55

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