發(fā)布時(shí)間：2017-12-08 21:31

  本文關(guān)鍵詞：輻射敏感基因作為潛在生物劑量計(jì)的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：電離輻射能夠?qū)е翫NA斷裂引起基因表達(dá)發(fā)生變化,推測電離輻射敏感基因可能發(fā)展成為輻射損傷生物標(biāo)志物,用于生物劑量的估算�，F(xiàn)有的生物劑量計(jì)存在耗時(shí)耗力的問題,不能滿足大批量受照人群的快速檢測,因此需要建立一種快速、高通量的生物劑量估算方法應(yīng)對大批量受照人群的劑量估算。本文將在前期基因芯片研究的基礎(chǔ)上,對篩選出的輻射后差異表達(dá)、具有一定的劑量依賴性、本底值相對均一的TRIAP1、RPS27L、AEN、C12orf5、SPIB 5個(gè)輻射誘導(dǎo)上調(diào)基因和TCL1A 1個(gè)輻射誘導(dǎo)下調(diào)基因,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行深入研究,探索這些基因作為新型分子輻射生物劑量計(jì)的可行性。目的:研究輻射敏感基因照射后的時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)關(guān)系以及健康人的本底水平,探討其作為輻射損傷早期生物標(biāo)志物應(yīng)用于生物劑量估算的可行性。方法:1通過對TRIAP1、RPS27L、AEN、C12orf5、TCL1A、SPIB 6個(gè)輻射敏感基因和β-actin 1個(gè)內(nèi)參基因的引物特異性檢測、探針非特異性排除、反應(yīng)溫度的優(yōu)化、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立,建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法。2采用不同劑量(0Gy、0.5Gy、1Gy、2Gy、4Gy、6Gy、10Gy)的60Coγ射線照射正常人外周血,在照射后培養(yǎng)不同時(shí)間(0h、2h、4h、8h、12h、24h)收集,提取全血總RNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的Taq Man探針兩步法檢測照射后TRIAP1、RPS27L、AEN、C12orf5、TCL1A、SPIB 6個(gè)輻射敏感基因的m RNA表達(dá)水平,觀察其隨受照劑量和培養(yǎng)時(shí)間的表達(dá)變化,篩選具有輻射損傷生物標(biāo)志物潛力的基因。3采集29名健康志愿者的外周血進(jìn)行TRIAP1、RPS27L、AEN 3個(gè)基因本底水平的分析(男性15名,女性14名;年齡組分別為21-30歲組10人,31-40歲組10人,41-50歲組9人),提取全血總RNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的Taq Man探針兩步法檢測輻射敏感基因m RNA的本底表達(dá)水平。4采用6-8周齡體重18-22g的雄性C57BL/6小鼠,進(jìn)行不同劑量(2Gy、8Gy)的γ射線整體照射,未照射樣0Gy為對照組;照射后不同時(shí)間點(diǎn)(4h、8h、12h、24h、48h、72h)采集血樣提取總RNA,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的Taq Man探針兩步法檢測照射后TRIAP1、RPS27L、AEN 3個(gè)輻射敏感基因和18S RNA 1個(gè)內(nèi)參基因m RNA隨劑量和時(shí)間的表達(dá)變化,研究輻射敏感基因在小鼠的整體照射后的表達(dá)效應(yīng)。結(jié)果:1通過對6個(gè)輻射敏感基因和β-actin內(nèi)參基因引物特異性的檢測、探針非特異性排除、反應(yīng)溫度的優(yōu)化、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立,建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測方法。2在對外周血進(jìn)行不同劑量照射培養(yǎng)不同時(shí)間后,與對照組相比,TRIAP1基因在2h、4h開始增加,8h達(dá)到峰值10.44,12h、24h略有下降,在8h、12h和24h呈現(xiàn)出較好的劑量依賴關(guān)系;RPS27L在2h各劑量下無明顯增加,4h開始逐漸增加,8h達(dá)到峰值9.97,12h和24h下降至與4h相近的水平,在4h、8h、12h和24h呈現(xiàn)出較好的劑量依賴關(guān)系;AEN基因在2h開始增加,4h、8h和12h持續(xù)增加并呈現(xiàn)出一定的劑量飽和效應(yīng),24h開始下降但仍高于本底;C12orf5基因在2h各劑量點(diǎn)下均無顯著增加,4h開始增加明顯,8h、12h和24h表達(dá)變化水平相近呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性;TCL1A基因在2h各劑量點(diǎn)下均無顯著減少,在4h、8h、12h和24h略有減少但未呈現(xiàn)出明顯劑量依賴關(guān)系;SPIB基因在4h、8h表達(dá)水平升高但無顯著性差異,在2h、12h和24h在各劑量點(diǎn)下幾乎沒有響應(yīng)。3不同劑量照射后,TRIAP1基因在8h、12h和24h擬合0.5-10Gy的劑量效應(yīng)曲線分別為y=2.663ln(x)+4.3668,R2=0.9969;y=1.6162ln(x)+3.6017,R2=0.9799;y=1.0839ln(x)+2.9733,R2=0.9562;RPS27L基因在4h,8h,12h和24h 0.5-10Gy的劑量效應(yīng)擬合曲線分別為y=0.7608ln(x)+2.141,R2=0.9594;y=2.1686ln(x)+4.3925,R2=0.9636;y=0.8334ln(x)+2.4676,R2=0.9684;y=0.4786ln(x)+2.023,R2=0.9204;AEN基因在2h,4h,8h進(jìn)行0.5-6Gy劑量范圍的劑量效應(yīng)擬合曲線分別為y=1.31ln(x)+2.1332,R2=0.9326;y=2.3864ln(x)+5.2762,R2=0.9913;y=4.6111ln(x)+8.4048,R2=0.9829,在12h和24h進(jìn)行0.5Gy-4Gy劑量范圍的劑量效應(yīng)擬合曲線分別為y=2.5651ln(x)+5.3049,R2=0.9715;y=1.8254ln(x)+4.7758,R2=0.9686。所有曲線方程的R2均大于0.92,說明劑量效應(yīng)關(guān)系顯著。4通過29個(gè)健康人本底水平檢測后的結(jié)果得出,TRIAP1基因本底值是0.170±0.031,波動(dòng)范圍0.101-0.248,變異系數(shù)18.086%;RPS27L基因的平均值為1.450±0.183,波動(dòng)范圍是1.085-1.775,變異系數(shù)是12.641%;AEN基因的平均值為0.056±0.010,波動(dòng)范圍是0.041-0.075,變異系數(shù)是18.001%。3個(gè)基因的變異系數(shù)均在20%以內(nèi),波動(dòng)范圍小且相對均一。分別對TRIAP1、RPS27L和AEN基因進(jìn)行年齡和性別因素的差異性分析,結(jié)果顯示TRIAP1、RPS27L和AEN均不受年齡因素(P分別為0.732、0.284、0.153)和性別因素(P分別為0.445、0.469、0.278)影響。5 2Gy和8Gy照射小鼠并在照射后飼養(yǎng)不同時(shí)間,與對照組相比,TRIAP1基因在照射后0-48h隨時(shí)間的延長表達(dá)水平不斷上升,在24h、48h和72h表達(dá)水平具有顯著性差異(P0.05),在48h達(dá)到峰值15.18,72h略有下降;RPS27L基因在4h和8h表達(dá)變化水平較高僅在8Gy劑量下4h與對照比無顯著性差異,12h迅速下降,24-72h逐漸恢復(fù)至接近本底水平;AEN基因在4h開始逐漸升高,24h達(dá)到峰值4.10,隨后逐漸下降,在8-72h表現(xiàn)出一定的差異性(P0.05)。TRIAP1、RPS27L和AEN基因在0Gy、2Gy和8Gy照射下無顯著劑量依賴關(guān)系。結(jié)論:1建立了Taq Man探針兩步法的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測方法。2γ射線不同劑量照射人外周血后培養(yǎng)不同時(shí)間,TRIAP1、RPS27L和AEN在不同的時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平顯著升高并且具有較好的劑量依賴關(guān)系,提示這3個(gè)輻射敏感基因具有作為輻射損傷生物標(biāo)志物的潛力,適用于輻射損傷早期生物劑量的估算。TCL1A、SPIB基因時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)關(guān)系不顯著,C12orf5基因相對表達(dá)變化水平低,這3個(gè)基因不具有作為輻射敏感基因的潛力。3通過本底水平的檢測,TRIAP1、RPS27L和AEN基因本底波動(dòng)范圍小、本底水平均一且不受年齡和性別因素的影響,滿足作為生物標(biāo)志物的要求。4通過小鼠整體照射的研究發(fā)現(xiàn),TRIAP1、RPS27L和AEN基因在小鼠體內(nèi)均有響應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R818

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