本文關(guān)鍵詞：IL-37對模擬失重下LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的防護(hù)作用

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【摘要】：背景/目的:構(gòu)建IL-37b真核表達(dá)載體,利用細(xì)胞回轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)模擬失重,探討IL-37對模擬失重下LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的防護(hù)作用。方法:1.從人PBMCs中提取總RNA,利用RT-q PCR技術(shù)擴(kuò)增出IL-37b基因編碼區(qū)序列,克隆至p EGFP-N1真核表達(dá)載體,將構(gòu)建的重組質(zhì)粒p EGFP-N1/IL-37b轉(zhuǎn)染到THP-1細(xì)胞中,通過RT-q PCR和Western blot檢測IL-37的表達(dá)。2.以THP-1細(xì)胞為研究對象,利用細(xì)胞回轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)模擬失重,采用CCK-8法分別檢測回轉(zhuǎn)0h、6h、12h、24h、36h、48h對細(xì)胞增殖的影響,從而建立細(xì)胞失重模型,在此基礎(chǔ)上給予LPS刺激細(xì)胞,通過RT-q PCR和ELISA技術(shù)檢測模擬失重下LPS誘導(dǎo)釋放的炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)。3.利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)實(shí)現(xiàn)IL-37b在THP-1細(xì)胞中的過表達(dá),通過RT-q PCR、ELISA以及Western blot技術(shù)研究IL-37對模擬失重下LPS誘導(dǎo)釋放炎癥因子的影響。結(jié)果:1.雙酶切及基因測序結(jié)果顯示IL-37b基因正確插入真核表達(dá)載體pEGFP-N1中;RT-q PCR和Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞后,IL-37表達(dá)水平明顯升高(P0.01)。2.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,較短的回轉(zhuǎn)時(shí)間(24h)對THP-1細(xì)胞的增殖無顯著影響,回轉(zhuǎn)48h時(shí)模擬失重對細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)最為明顯(P0.01)。進(jìn)一步給予細(xì)胞LPS刺激,RT-q PCR結(jié)果顯示,與單純給予LPS組相比,三種炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)上調(diào)(P0.05、P0.01、P0.01);ELISA結(jié)果顯示,細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量較LPS組升高(P0.05、P0.05、P0.05)。3.RT-q PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染IL-37b后,與未轉(zhuǎn)染組相比,模擬失重下LPS刺激細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)降低(P0.05、P0.01、P0.05),IL-37b明顯升高(P0.01),NF-κB降低(P0.05);ELISA結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染IL-37b后,與未轉(zhuǎn)染組相比,模擬失重下LPS刺激細(xì)胞釋放的TNF-α、IL-6、IL-1β減少(P0.05、P0.05、P0.05);Western blot結(jié)果表明,THP-1細(xì)胞在正常條件下可以穩(wěn)定低表達(dá)IL-37,但在模擬失重條件下給予LPS刺激,IL-37的表達(dá)較對照組明顯升高,同時(shí)NF-κB p65的表達(dá)也明顯升高;將IL-37b轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞后,與未轉(zhuǎn)染組相比,過表達(dá)的IL-37可以明顯抑制在模擬失重條件下由LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65的表達(dá)。結(jié)論:成功構(gòu)建了新型抗炎因子IL-37的真核表達(dá)載體pEGFP-N1/IL-37b,并初步發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的IL-37可能通過抑制NF-κB的表達(dá)最終實(shí)現(xiàn)抑制炎癥因子的分泌。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R852.22

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本文編號：1250253