本文關(guān)鍵詞：小劑量X射線誘導(dǎo)小鼠DNA甲基化譜改變的研究

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【摘要】：研究背景： 隨著核能在國(guó)民經(jīng)濟(jì)和軍事領(lǐng)域中應(yīng)用的擴(kuò)展,電離輻射對(duì)人類的潛在危害也不斷增加。與大劑量輻射事件或事故的發(fā)生相比,小劑量暴露雖不足以引起臨床可觀察到的急性放射性損傷,但若不及時(shí)采取有效的檢測(cè)、危害評(píng)價(jià)和防護(hù)措施,將會(huì)給更多的人員造成遠(yuǎn)后效應(yīng)形式的健康危害,并且可能因嚴(yán)重的心理?yè)p害而加重其他因素對(duì)健康的危害。因此,加強(qiáng)小劑量輻射(low dose radiation, LDR)對(duì)機(jī)體損傷的基礎(chǔ)研究,對(duì)人類提高小劑量輻射對(duì)人體健康危害的認(rèn)識(shí)及其防護(hù)具有重要意義。 LDR對(duì)人體產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)復(fù)雜,隨射線性質(zhì)、劑量大小及受照個(gè)體的不同而有不同的表現(xiàn)形式,主要表現(xiàn)在以下四個(gè)方面：(1)適應(yīng)性反應(yīng)；(2)輻射超敏感性；(3)旁效應(yīng)；(4)輻射誘導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定性(radiation-induced genomic instability, RIGI)。這些效應(yīng)可以誘導(dǎo)多種系統(tǒng)急、慢性疾病及腫瘤的發(fā)生,同時(shí)還可以引起子女遺傳性疾病和先天性畸形發(fā)病率的增高。其中RIGI表現(xiàn)為親代輻射暴露細(xì)胞的子代細(xì)胞中存在著較高的細(xì)胞遺傳學(xué)異常,這種改變具有遺傳特性,包括DNA雙鏈斷裂、缺失突變率增高、基因表達(dá)改變、線粒體功能紊亂、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡、微衛(wèi)星不穩(wěn)定等。大量研究表明,RIGI與表觀遺傳學(xué)密切相關(guān)。 DNA甲基化是最重要的一種表觀遺傳修飾方式。LDR引起的DNA甲基化具有劑量依賴性、性別差異性、組織特異性,具體表現(xiàn)在二方面：(1)輻射誘導(dǎo)全基因組DNA低甲基化；(2)輻射誘導(dǎo)抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化。前者可導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定性,后者使抑癌基因的轉(zhuǎn)錄失活,與胚胎發(fā)育和腫瘤疾病有著密切聯(lián)系。Rad23b蛋白和XPC、中心體蛋白2共同組成了DNA損傷識(shí)別復(fù)合體,與DNA損傷的堿基或糖磷酸位點(diǎn)結(jié)合,參與了核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair, NER)信號(hào)通路；Ddit3基因編碼的蛋白參與脂肪細(xì)胞和紅細(xì)胞生成,通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活促進(jìn)凋亡,充當(dāng)抑癌基因的角色。在一些腫瘤中,兩者均表現(xiàn)為高甲基化狀態(tài),被視為抑癌基因,然而兩者在輻射引起的表觀遺傳學(xué)改變中尚未見(jiàn)報(bào)道。 目前,LDR所致DNA甲基化改變的相關(guān)研究多集中在基因組的整體甲基化水平,國(guó)內(nèi)外仍缺乏LDR對(duì)機(jī)體生物學(xué)影響的具體方面及特定基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的系統(tǒng)性體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。因此,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建不同的小劑量X射線輻射方式的BALB/c小鼠模型,在觀察各組織標(biāo)本全基因組甲基化水平外,利用高通量甲基化芯片技術(shù)建立全血甲基化差異譜,進(jìn)一步鑒定及篩選代表性基因在各組織標(biāo)本中啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)及mRNA表達(dá)水平。 目的： 通過(guò)構(gòu)建LDR小鼠模型,應(yīng)用高通量的甲基化芯片技術(shù),基于甲基化譜的聚類分析初步描述LDR對(duì)機(jī)體靶器官的影響,及其涉及到的生物學(xué)過(guò)程。為小劑量輻射疾病的預(yù)防和早期診斷、疾病分型、預(yù)后判斷和分子靶向藥物的開(kāi)發(fā)提供重要依據(jù)。 方法： 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組：實(shí)驗(yàn)用SPF級(jí)BALB/c小鼠30只,雄性,4—6周齡(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)中心),隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：對(duì)照組、0.5Gy單次照射組(急性照射組)和0.5Gy分次照射組(0.05Gy/d×10d,慢性照射組),每組10只。 2.照射方法及標(biāo)本采集：X射線裝置為瑞典醫(yī)科達(dá)Precise型直線加速器,源皮距為100cm,劑量率為270cGy/min。分次照射組小鼠每天同一時(shí)間接受X射線0.05Gy全身照射,連續(xù)照射10天,第10天單次照射組小鼠接受0.5Gy全身照射。其中,分析小劑量射線早期效應(yīng)的3組小鼠(每組按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)取5只,共15只),在末次照射后2h眼球摘除取血后處死,收集腎臟、肝臟、脾臟、腦及肺組織。分析遠(yuǎn)后效應(yīng)的15只小鼠在末次照射后30d以同樣方式采血、處死、收集各組織標(biāo)本。 3.全基因組甲基化水平：各組血及組織DNA、RNA、蛋白提��；DNA水解,高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)檢測(cè)血液基因組整體甲基化水平；熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR (real-time RT-PCR)和westen blot檢測(cè)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase1, DNMT1)、甲基化CpG結(jié)合蛋白2(methyl-CpG binding domain protein2, MBD2) mRNA表達(dá)和蛋白水平。 4.甲基化譜的篩選及鑒定：通過(guò)Roche-NimbleGen小鼠甲基化DNA免疫共沉淀芯片(methylated DNA immunoprecipitation chip, MeDIP-chip),篩選三種不同照射方式的甲基化差異基因,進(jìn)一步做基因分類(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(shū)(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)信號(hào)通路分析；對(duì)8個(gè)代表性基因(Rad23b, Tdg, Ccnd1, Ddit3, Llgl1, Rasll1a, Tbx2, Slc6al5)進(jìn)行MeDIP-qPCR驗(yàn)證;亞硫酸鹽測(cè)序(bisulfite sequencing PCR, BSP)和real-time RT-PCR比較照射前后Rad23b和Ddit3在不同組織標(biāo)本中的甲基化和mRNA表達(dá)水平。 5.采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組均數(shù)間比較用t檢驗(yàn),兩組以上的組間比較采用單向方差分析,P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.全血基因組甲基化水平改變：輻射后2h,分次照射組較對(duì)照組甲基化水平顯著降低[(2.82±0.31)%vs (4.67±0.17)%, t=8.93, P0.05],而單次照射組(4.43±0.13)與對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。末次照射1個(gè)月后,單次照射組(4.61±0.11)%、分次照射組(4.42±0.12)%甲基化水平較對(duì)照組(4.67±0.17)%差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2. DNMT1和MBD2在各組織中的mRNA和蛋白水平：與對(duì)照組比較,末次輻射后2h,分次照射組小鼠DNMT1mRNA水平在血液、腎臟和肝臟中明顯減少(P0.05),同時(shí),MBD2mRNA表達(dá)在血液、腎臟、肝臟和脾臟中也降低(P0.05)；單次照射組DNMT1和MBD2mRNA表達(dá)在各組織中差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。然而,遠(yuǎn)后效應(yīng)中,分次照射組小鼠僅MBD2mRNA表達(dá)在血液和腦組織中較對(duì)照組顯著降低(P0.05),DNMT1mRNA表達(dá)在肝臟組織中反而較對(duì)照組升高(P0.05)；單次照射組DNMT1和MBD2mRNA表達(dá)在血液及各組織中較對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。western blot亦證實(shí)了這一結(jié)果(P0.05)。 3.在芯片結(jié)果中,根據(jù)對(duì)照組和單次照射組均未發(fā)生甲基化、分次照射組發(fā)生甲基化的條件,共篩選811個(gè)甲基化差異基因。進(jìn)行GO和KEGG信號(hào)通路分析,發(fā)現(xiàn)這些差異基因幾乎涉及所有的主要生物學(xué)過(guò)程,如大分子代謝、基因表達(dá)、發(fā)育過(guò)程、細(xì)胞增殖與分化等；信號(hào)通路如背腹軸形成、mTOR信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路等。 4.在811個(gè)差異基因中,根據(jù)Peak Score2, Peak MValue0.7,啟動(dòng)子類型為含CpG高的啟動(dòng)子(high CpG-containing promoter, HCP)或含中等量CpG的啟動(dòng)子(intermediate CpG-containing promoter, ICP),基因類型涉及到損傷修復(fù)、細(xì)胞周期、凋亡、增殖等條件下,挑選8個(gè)代表性基因(Rad23b, Tdg, Ccndl, Ddit3, Llgll, Rasll1a, Tbx2, Slc6a15)進(jìn)一步MeDIP-qPCR驗(yàn)證,結(jié)果與芯片一致(P0.05),證實(shí)芯片結(jié)果的可靠性。 5. Rad23b和Ddit3在各組織標(biāo)本中的甲基化和mRNA表達(dá)水平：與對(duì)照組和單次照射組比較,早期效應(yīng)中,分次照射組Rad23b在血液、肝臟、脾、腦和肺組織的啟動(dòng)子均發(fā)生了高甲基化(P0.05)；Ddit3在血液、肝臟和肺組織中啟動(dòng)子發(fā)生高甲基化(P0.05)。遠(yuǎn)后效應(yīng)中,除了脾組織中的Rad23b和肺的Ddit3甲基化程度比2h降低外(P0.05),其余仍保持高甲基化狀態(tài)(P0.05).Real-time RT-PCR檢測(cè)Rad23b和Ddit3在各組織中的mRNA表達(dá)水平,結(jié)果提示基因啟動(dòng)子高甲基化的組織中均mRNA水平降低。 結(jié)論： 1.證實(shí)了小劑量X射線照射可引起小鼠全血基因組的低甲基化,且分次照射比單次照射更明顯；全基因組的低甲基化可能與DNMT1和MBD2的表達(dá)下降有關(guān)。 2.首次系統(tǒng)性探討了分次小劑量X射線照射可引起某些特定基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化,這些差異基因幾乎涉及到所有生物學(xué)過(guò)程,為進(jìn)一步探索小劑量輻射相關(guān)效應(yīng)的分子調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。 3.在小劑量X射線小鼠模型中篩選出分次照射組誘導(dǎo)的一組敏感而特異的甲基化譜,為揭示其發(fā)病機(jī)制提供新的線索,有望為通過(guò)抑制機(jī)體DNA甲基化的方法及藥物達(dá)到預(yù)防和治療長(zhǎng)期小劑量輻射引起的各種疾病提供重要依據(jù)。 4.輻射損傷相關(guān)基因Rad23b和細(xì)胞周期相關(guān)基因Ddit3的啟動(dòng)子持續(xù)性甲基化與低表達(dá)狀態(tài)可能參與輻射誘導(dǎo)疾病的發(fā)生,為輻射誘導(dǎo)疾病的臨床分子預(yù)測(cè)和防護(hù)藥物開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R814

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 封冰;陳龍邦;;微小RNA與表觀遺傳調(diào)控:腫瘤治療新策略[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2011年01期

2 王震凱;汪芳裕;;DNA甲基化與腫瘤[J];醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào);2011年06期

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本文編號(hào)：1243145