發(fā)布時(shí)間：2017-11-06 10:32

  本文關(guān)鍵詞：Chelex-100 DNA模板用于H19印記基因座遺傳多態(tài)性的檢測(cè)及其在山西漢族人群中分布研究

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【摘要】：目的 (1)對(duì)Chelex-100法提取DNA作為Hha Ⅰ酶切底物應(yīng)用于印記基因H19上游區(qū)域差異甲基化可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)的檢測(cè)進(jìn)行探索,以期在法醫(yī)實(shí)際工作中提供一種檢測(cè)差異甲基化遺傳多態(tài)性的簡便省時(shí)方法。 (2)對(duì)印記基因H19上游區(qū)域VNTR基因座在山西漢族人群中遺傳多態(tài)性進(jìn)行研究。 方法 (1)摸索用于酶切消化的最佳基因組DNA量,選取酚氯仿法提取的基因組DNA30ng,25ng,15ng分別進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)H19印記基因座位中同一雜合子樣本分別用Chelex-100法和酚氯仿法提取DNA, Chelex-100法提取的DNA作為實(shí)驗(yàn)組,經(jīng)典酚氯仿法提取的DNA作為陽性對(duì)照組。分別設(shè)計(jì)Hha Ⅰ消化組與Hha Ⅰ未消化組(未消化組由等量的去離子水代替),PCR擴(kuò)增,EB染色后觀察兩種提取方法檢測(cè)的結(jié)果。Chelex-100法提取的DNA定量采用實(shí)時(shí)定量PCR法。 分析74份Chelex-100法提取的雜合子樣本DNA消化后PCR電泳結(jié)果,應(yīng)用ImageJ軟件分析計(jì)算出消化后PCR兩個(gè)雜合子帶光密度比值與未消化組PCR兩個(gè)雜合子帶光密度比值。比值=來自父源帶光密度值/來自母源帶光密度值,對(duì)兩組光密度比值用SPSS軟件進(jìn)行分析。 (2)100例山西漢族無關(guān)個(gè)體PCR擴(kuò)增,EB染色后觀察。對(duì)印記基因H19上游區(qū)域VNTR基因座的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析。 結(jié)果 (1)在反應(yīng)總體積為HhaI(NEB)為30U37℃C消化15小時(shí)條件下,底物DNA量選取15ng其酶切效果最佳。陽性對(duì)照組(酚氯仿提取DNA) Hha Ⅰ消化后PCR擴(kuò)增只觀察到一條條帶。實(shí)驗(yàn)組Hha Ⅰ消化后PCR擴(kuò)增,兩個(gè)雜合子帶強(qiáng)度差異肉眼可辨,來自母源的而Hha Ⅰ未消化組PCR擴(kuò)增,兩個(gè)雜合子帶無顯著差別。Chelex-100法提取DNA Hha Ⅰ消化后擴(kuò)增較弱帶與陽性對(duì)照組被HhaⅠ切割而未擴(kuò)增出來的母源帶一致。 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的結(jié)果,兩組的光密度比值均符合正態(tài)分布,配對(duì)t檢驗(yàn),P0.05,兩組間光密度比值差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單樣本t檢驗(yàn)消化組比值95%置信區(qū)間為3.63—4.13。未消化組光密度比值95%置信區(qū)間為1.08-1.18。Hha Ⅰ消化后PCR兩條條帶光密度比值位于3.63—4.13。即可分辨父源或母源的遺傳多態(tài)性條帶。 (2)100例山西漢族無關(guān)個(gè)體中印記基因H19上游區(qū)域VNTR基因座共檢出5種等位基因,分別為6、7、9、10、11。經(jīng)χ2值檢驗(yàn),其等位基因頻率分布與Hardy-Weinberg平衡(P0.05)相吻合。雜合度(h)：0.74,多態(tài)信息含量(PIC)：0.621,個(gè)人識(shí)別率(DP)：0.892。 結(jié)論 (1) Chelex-100法提取的DNA能夠作為甲基化敏感限制性內(nèi)切酶Hha Ⅰ酶切底物應(yīng)用于印記基因H19上游區(qū)域差異甲基化的檢測(cè),HhaⅠ消化后PCR擴(kuò)增兩條條帶光密度比值在3.63—4.13區(qū)間時(shí)可分辨父源或母源的遺傳多態(tài)性條帶。 (2)印記基因H19上游區(qū)域VNTR基因座在山西漢族人群中具有高度遺傳多態(tài)性,可用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：D919

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1148556