本文關(guān)鍵詞：褪黑素對(duì)放療后大鼠卵巢功能的保護(hù)作用及其機(jī)制的研究

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【摘要】：研究背景 卵巢功能減退是指卵巢內(nèi)分泌功能和生育能力下降,并與女性生理年齡不符,常見的原因有遺傳、腫瘤、自身免疫、醫(yī)源性等因素。放射治療是治療惡性腫瘤最常用的方法之一,對(duì)于女性患者最大的弊端是導(dǎo)致卵巢功能減退甚至衰竭。放射治療是由一種或多種電離輻射的治療方式組成的醫(yī)學(xué)治療。通俗的講,放射治療就是利用放射源或各種醫(yī)療設(shè)備產(chǎn)生的高能射線對(duì)腫瘤進(jìn)行治療的技術(shù),簡稱“放療”(radiotherapy, RAD)。放療設(shè)備產(chǎn)生的射線對(duì)任何生物都會(huì)產(chǎn)生物理學(xué)效應(yīng)、化學(xué)效應(yīng)、生物反應(yīng)等一系列輻射生物效應(yīng)。射線的這種特性叫電離輻射。射線正是利用該特性治療腫瘤。醫(yī)用電子直線加速器：是利用微波電場,沿直線加速電子到較高的能量應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床的裝置。其中放療設(shè)備產(chǎn)生的電離射線可以與組織中的水分子發(fā)生作用形成高活性的自由基團(tuán),這些自由基團(tuán)可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,凋亡的途徑主要有外在途徑(extrinsic pathway),由細(xì)胞表面的死亡受體如腫瘤壞死因子受體家族(tumor necrosis factor receptor, TNF-R)引發(fā);另一種稱為內(nèi)在途徑(intrinsic pathway)或線粒體途徑(mitochondrial pathway),由許多應(yīng)激條件、化學(xué)治療試劑和藥物所引發(fā)。線粒體為一雙層膜圍成的囊狀結(jié)構(gòu),外膜與內(nèi)膜間的空腔稱為外室,由內(nèi)膜包圍的腔稱為內(nèi)室或線粒體基質(zhì),線粒體外膜通透性較大,而內(nèi)膜通透性比較小。然而質(zhì)子泵存在于內(nèi)膜,它將基質(zhì)內(nèi)質(zhì)子泵輸入外室,從而形成橫跨線粒體內(nèi)膜的線粒體跨膜電位(mitochondrial transmembrane potential, MTP).線粒體跨膜電位的改變與許多的機(jī)制有關(guān)。通過實(shí)驗(yàn)證明凋亡發(fā)生時(shí),線粒體膜電位降低,線粒體膜通道孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)開放,進(jìn)而線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C (cytochrome c, cytc)釋放進(jìn)入胞質(zhì),引起半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。此外, C aspase是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白酶,能夠特異的切割靶蛋白。Caspase主要負(fù)責(zé)的是選擇性地切割某些蛋白質(zhì),切割的結(jié)果是使靶蛋白活化或失活,并非完全降解。目前很多研究證明了Caspase1和3與線粒體跨膜電位之間存在關(guān)聯(lián),研究表明：所有動(dòng)物細(xì)胞都具有類似的凋亡機(jī)制,蛋白酶Caspase在其中發(fā)揮很重要的作用,這種凋亡方式被稱為Caspase依賴性的細(xì)胞凋亡。 褪黑素(N-acetyl-5-methoxytryptamine, MT)作為一種由哺乳動(dòng)物和人類的松果體產(chǎn)生的胺類激素為人們所熟知。大量研究表明,褪黑素可以調(diào)節(jié)光周期動(dòng)物的生殖活動(dòng)。早期的研究報(bào)道了下丘腦和垂體前葉可以調(diào)節(jié)褪黑素的合成。這在一定程度上也證明了褪黑素的受體存在于大腦的視交叉上核和垂體結(jié)節(jié)部。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)在卵巢中有褪黑素受體的存在,這表明了褪黑素對(duì)生殖系統(tǒng)的重要影響。近年來學(xué)者們對(duì)褪黑素清除自由基的作用進(jìn)行了廣泛的研究。發(fā)現(xiàn)其對(duì)抗由放療/化療及自身免疫性疾病引起的卵巢功能損傷有著顯著作用。但對(duì)其保護(hù)卵巢功能的具體的機(jī)制尚不明確。 本實(shí)驗(yàn)以瑞典Elekta Precise醫(yī)用直線加速器全身照射大鼠制作放療致大鼠卵巢功能減退的模型,觀察放療后各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)改變,各級(jí)卵泡數(shù)量及激素水平的變化情況,分析不同劑量褪黑素對(duì)卵巢功能的保護(hù)作用,進(jìn)而通過觀察放療組氧化應(yīng)激指標(biāo)(羥基)與線粒體凋亡途徑指標(biāo)(線粒體膜電位、細(xì)胞色素C、caspase3活性),來研究放療是否通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)了卵巢組織的損傷,且損傷是否經(jīng)由線粒體通路發(fā)生。同時(shí)觀察褪黑素組中相應(yīng)指標(biāo)的變化,來闡明褪黑素保護(hù)卵巢功能的機(jī)制,為放療所致卵巢功能損傷的治療提供參考,最終將研究成果進(jìn)行轉(zhuǎn)換,用于提高臨床診療水平。 目的 通過分析放療后大鼠卵巢組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)(羥基)、線粒體膜電位、細(xì)胞色素C和caspase3活性的變化,探討放療所致卵巢功能損傷是否通過氧化應(yīng)激所誘導(dǎo),且該損傷是否經(jīng)由線粒體通路發(fā)生；同時(shí)給予不同劑量的外源性褪黑素治療卵巢功能損傷,觀察不同劑量組的卵巢功能損傷程度,來闡明褪黑素對(duì)卵巢功能的保護(hù)作用,為今后治療放療所導(dǎo)致卵巢功能減退以及相繼發(fā)生的女性生殖及和性功能減退的問題,提供依據(jù)和實(shí)驗(yàn)室研究基礎(chǔ)。 方法 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的篩選 清潔級(jí)SD雌性大鼠(體重180-200g),購置南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科。顆粒飼料喂養(yǎng),自由攝食,室溫20-25℃,相對(duì)濕度45%一55%,每日光照12h,飼養(yǎng)3天熟悉環(huán)境后,每日晨8：00取陰道分泌物涂片光鏡觀察性周期,選用有正常性周期的動(dòng)物進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。 2實(shí)驗(yàn)分組與放療模型的制作 將進(jìn)入實(shí)驗(yàn)的24只大鼠隨機(jī)分成4組：對(duì)照組(6只)、Rad組(6只).Rad+MT (50mg/kg)組(6只)、Rad+MT (100mg/kg)組(6只)。對(duì)照組：給予5m1酒精生理鹽水(0.9%生理鹽水和100%乙醇按9：1體積比配制)腹膜下注射；Rad組給予5m1酒精生理鹽水腹膜下注射,2h后接受總量為200cGy射線照射,照射速度50cGy/min,照射野30*30cm,照射距離150cm; Rad+MT (50mg/kg)組、Rad+MT (100mg/kg)組：分別給予相應(yīng)劑量的褪黑素溶解于5ml酒精生理鹽水腹膜下注射,2h后接受總量為200cGy射線照射(照射條件同射線照射組)。以上動(dòng)物于射線照射后每日陰道分泌物涂片觀察動(dòng)情周期,照射后2周于動(dòng)情間期處死大鼠,取雙側(cè)卵巢,右側(cè)卵巢4%多聚甲醛固定,左側(cè)卵巢存于液氮罐。大鼠腹主動(dòng)脈采血,分離血清。 3激素的測定 采用ELISA法測定大鼠血清中的雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)。按試劑盒操作說明進(jìn)行。 4卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察及卵泡計(jì)數(shù) 右側(cè)卵巢石蠟包埋,取最大橫斷面切片后HE染色,光鏡下計(jì)數(shù)具有正常卵泡結(jié)構(gòu)的卵泡數(shù),分別計(jì)數(shù)各組大鼠的原始卵泡、生長卵泡(包括初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡和竇卵泡)、成熟卵泡。 5羥自由基的測定 利用Fenton反應(yīng)測定左側(cè)卵巢組織中的羥自由基的濃度,Fenton反應(yīng)是常見的產(chǎn)生羥自由基的化學(xué)反應(yīng),過氧化氫的量與Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基的量成正比,當(dāng)給予電子受體后,用griess試劑顯色,形成紅色物質(zhì),其呈色與羥基的多少成正比。按試劑盒操作說明進(jìn)行。 6線粒體膜電位的測定 左側(cè)卵巢組織使用組織線粒體提取試劑盒分離胞漿和線粒體,JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位的理想熒光探針�？梢詸z測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位,在線粒體膜電位較高時(shí),JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix)中,形成聚合物(J-aggregates),可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí),JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中,此時(shí)JC-1為單體(monomer),可以產(chǎn)生綠色熒光。這樣就可以非常方便地通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變來檢測線粒體膜電位的變化。常用紅綠熒光的相對(duì)比例來衡量線粒體去極化的比例,按試劑盒操作說明進(jìn)行。 7細(xì)胞色素C的測定 左側(cè)卵巢組織使用組織線粒體提取試劑盒分離胞漿和線粒體,使用ELISA法測定大鼠卵巢組織中細(xì)胞色素C的濃度 8caspase3活性的測定 采用分光光度法測定大鼠卵巢組織caspase3活性。由于caspase3可催化底物Ac-DEVD-pNA產(chǎn)生黃色物質(zhì)pNA,因此通過測定pNA在405nm的吸光度來測定caspase3活性。按試劑盒操作說明進(jìn)行。 9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有指標(biāo)采用SPSS18進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間差異的比較用單因素方差分析(One-Way ANOVA),兩兩組間比較采用最小顯著差異法(LSD)檢驗(yàn),若方差不齊,兩兩比較采用基于t檢驗(yàn)的保守Tambane's T2檢驗(yàn),以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1大鼠動(dòng)情周期變化 各組大鼠干預(yù)前均為正常動(dòng)情周期,4天為1周期。Rad組接受照射后僅出現(xiàn)動(dòng)情后期或動(dòng)情間期。Rad+MT (50mg/kg)組、Rad+MT (100mg/kg)組大鼠照射后僅出現(xiàn)動(dòng)情后期或動(dòng)情間期,一周后恢復(fù)正常動(dòng)情周期。對(duì)照組動(dòng)情周期無改變。 2大鼠血雌激素(E2)和卵泡刺激素(FSH)水平變化 正常對(duì)照組、Rad+MT (100mg/kg)組、Rad+MT (50mg/kg)組、Rad組中血E2水平依次降低,FSH水平依次升高,其中Rad+MT (50mg/kg)組與Rad+MT (100mg/kg)組比較,FSH水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其余各組比較,E2和FSH水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3大鼠卵泡數(shù)量變化及光鏡下卵巢組織形態(tài)學(xué)改變 正常對(duì)照組、Rad+MT (100mg/kg)組、Rad+MT (50mg/kg)組、Rad組的卵泡總數(shù)依次減少,各組間比較,卵泡總數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 光鏡下：對(duì)照組卵巢,清晰可見各級(jí)正常發(fā)育的竇卵泡及發(fā)育成熟的卵泡；Rad組卵巢,各級(jí)卵泡數(shù)量明顯減少,見大量閉鎖卵泡及大量陳舊樣黃體；Rad+MT (100mg/kg)組卵巢,可見各級(jí)正常發(fā)育的竇卵泡及發(fā)育成熟的卵泡,并見少量黃體。 4大鼠卵巢組織羥基濃度、capase3活性、細(xì)胞色素C濃度及線粒體膜電位的變化 在正常對(duì)照組、Rad+MT (100mg/kg)組、Rad+MT (50mg/kg)組、Rad組的卵巢組織中,羥基濃度、capase3活性、細(xì)胞色素C濃度依次升高,而線粒體膜電位則依次降低。各組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 本研究證明了放療可致卵巢組織發(fā)生不可逆的損傷并伴隨激素水平的變化。分析放療后大鼠卵巢組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)(羥基)與線粒體凋亡途徑指標(biāo)(線粒體膜電位、細(xì)胞色素C、caspase3活性),發(fā)現(xiàn)羥基的濃度、細(xì)胞色素C的濃度及caspase3的活性與卵巢組織損傷存在正相關(guān),而線粒體膜電位與卵巢組織損傷的存在負(fù)相關(guān),可以推測放療促使機(jī)體產(chǎn)生了氧化應(yīng)激,而氧化應(yīng)激誘導(dǎo)了卵巢組織的損傷,且該損傷正是經(jīng)由線粒體凋亡通路發(fā)生；并通過分析不同劑量褪黑素治療組卵巢組織損傷程度的變化,發(fā)現(xiàn)褪黑素對(duì)放療所致卵巢功能損傷具有保護(hù)作用,且呈劑量依賴性,此外,褪黑素劑量依賴性地降低了卵巢組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)羥基的濃度,并且抑制了線粒體膜電位的降低、細(xì)胞色素C的釋放以及caspase3的激活,因此我們得出結(jié)論：褪黑素的抗氧化和抗凋亡特性可以減輕放療所致的卵巢功能損傷。
【關(guān)鍵詞】：褪黑素 放療 大鼠 卵巢 氧化應(yīng)激 線粒體凋亡途徑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R711.75;R730.55
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-22
• 第一章 放療致卵巢功能減退模型的制作及褪黑素對(duì)卵巢功能保護(hù)的研究22-32
• 第一節(jié) 研究目的22
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法與材料22-29
• 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及附圖29-32
• 第二章 放療后卵巢組織中羥基、細(xì)胞色素C、線粒體膜電位、CASPASE3活性的變化及褪黑素保護(hù)卵巢功能機(jī)制的探討32-40
• 第一節(jié) 研究目的32
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法與材料32-38
• 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-40
• 第六章 討論40-43
• 第七章 全文小結(jié)43-44
• 參考文獻(xiàn)44-47
• 中英文縮略詞表47-48
• 綜述48-56
• 參考文獻(xiàn)54-56
• 成果56
• 致謝56-59

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號(hào)：1078682