本文關鍵詞：兩種典型OPFRs對PC12細胞的神經毒性及其機制探究

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【摘要】：隨著世界范圍內溴代阻燃劑的廣泛禁用,有機磷酸酯類阻燃劑的使用量大幅增加,這些阻燃劑作為添加劑加入到人類生產生活各種產品中,經過滲透、磨損逐漸滲入到周圍環(huán)境中,對人類和野生動物產生危害�？茖W家們對有機磷酸酯類阻燃劑進行調查研究,在水、土壤、魚類、鳥類體內檢測到了各種濃度范圍的有機磷酸酯類阻燃劑,且發(fā)現其具有內分泌和甲狀腺毒性,但對其神經毒性及其機制的研究尚少。本課題選取磷酸三(2,3-二氯丙基)酯(tris(2,3-dichloropropyl)phosphate,TDCPP)和三(2-羧乙基)磷(tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)兩種典型有機磷酸酯類阻燃劑為研究材料,以PC12神經元細胞為模型,開展了TDCPP和TCEP的神經毒性研究,并初步探索其可能的神經毒性作用生物分子機制。以NGF刺激分化的PC12細胞為體外培養(yǎng)神經細胞模型,選用暴露濃度為0-75μM的TDCPP和0-400μM的TCEP,分別對PC12細胞進行0-6天的染毒處理。采用倒置顯微鏡對細胞形態(tài)進行觀察,利用MTT法對細胞生存率進行測定,運用流式細胞儀對細胞凋亡和細胞內Ca2+改變進行熒光檢測;采用Western-Blotting(WB)技術對PC12細胞神經生長相關的關鍵蛋白(如Ca MK2、GAP43、tubulin、NF-H),以及MAPK信號通路蛋白及其磷酸化水平進行檢測和分析。并采用Ca MK2蛋白抑制劑KN93抑制Ca MK2活化后檢測MAPK通路磷酸化水平的改變,以期進一步揭示MAPK通路與Ca MK2蛋白磷酸化之間的關系。研究分為三個部分,培養(yǎng)細胞分組及主要研究結果如下:一、TDCPP/TCEP染毒PC12細胞導致其神經毒性檢測TDCPP暴露下PC12細胞生存率劑量效應的細胞分組為:正常對照組、TDCPP染毒1μM、5μM、15μM、20μM、25μM、50μM、75μM組共8組,染毒6天;檢測TCEP暴露下PC12細胞生存率劑量效應的細胞分組為:正常對照組、TCEP染毒15μM、20μM、40μM、80μM、150μM、200μM、400μM組共8組,染毒6天;為檢測染毒后生存率時間效應,染毒濃度為50μM TDCPP,細胞分別持續(xù)染毒0-6天,各持續(xù)染毒時間段均設有正常對照組,且每組設6復孔。實驗中對各組細胞實時觀察并拍照記錄。檢測TDCPP染毒后細胞凋亡率的實驗細胞分組為0μM、5μM、15μM、25μM、50μM TDCPP染毒組,染毒時間為持續(xù)染毒3天和持續(xù)染毒6天,每組設3復孔。顯微鏡觀察結果顯示在TDCPP或TCEP染毒作用下,PC12神經細胞的形態(tài)均發(fā)生改變,神經突觸長度變短數量減少,神經細胞間的神經絲連接減少、形成的神經結節(jié)也減少,神經細胞變圓變小,生存數量減少;不同染毒濃度的TDCPP/TCEP暴露下,PC12細胞生存率均減少,存在劑量效應關系;不同染毒持續(xù)時間的TDCPP暴露下,PC12細胞生存率亦減少,存在時間效應關系;不同濃度和不同染毒時間TDCPP暴露下,PC12細胞凋亡率呈現增多的趨勢,且同樣存在時間和劑量效應。這些結果均提示了TDCPP/TCEP對PC12細胞具有神經毒性,且表現在發(fā)育毒性和細胞毒性兩個方面。二、TDCPP/TCEP導致PC12細胞神經毒性的生物標志物實驗用PC12細胞以1×105細胞密度接種至6孔培養(yǎng)板中,隔天對細胞進行換液,培養(yǎng)液含終濃度為20μg/L的NGF以刺激分化PC12細胞。培養(yǎng)至細胞鋪率達70%后對細胞進行染毒換液。細胞分組為正常對照組、溶劑對照組、TDCPP5μM、15μM、25μM、50μM組;或正常對照組、溶劑對照組、TCEP 40μM、80μM、150μM、200μM組,每組3個復孔,2-3天換一次液,持續(xù)染毒6天。分別對各組PC12細胞進行收集,提取蛋白后采用WB技術檢測目標蛋白。結果顯示OPFRs影響PC12細胞內調節(jié)蛋白Ca MK2、GAP43的翻譯水平,TDCPP使其表達量相比正常細胞降低約20%-40%,且與TDCPP染毒存在劑量效應關系;TCEP使GAP43表達量相比正常細胞降低約50%,而CAMK2的表達水平呈現增長的趨勢。另外,PC12細胞內骨架蛋白tubulin、NF-H的翻譯水平在TDCPP作用下最大降幅約為30%,且同樣與TDCPP染毒存在劑量效應關系;而TCEP作用下骨架蛋白tubulin翻譯水平同樣降低約20%-30%,NF-H翻譯水平卻呈現增多的趨勢,最多相比正常組增加約1倍。所以,在OPFRs作用下神經生長相關蛋白翻譯水平的改變,可引起神經細胞生長發(fā)育受損,損傷神經細胞PC12的正常形態(tài),阻礙其發(fā)揮正常功能,從而引起PC12細胞神經毒性,而以上幾類與神經相關目標蛋白,可能成為其神經毒性效應主要的生物標志物。三、TDCPP導致PC12細胞神經毒性的可能分子生物機制流式細胞儀檢測細胞內Ca2+濃度水平的改變細胞分組為正常對照組、TDCPP5μM、15μM、25μM、50μM組,每組3個復孔,2-3天換一次液,分別持續(xù)染毒1-6天;WB檢測Ca MK2、MAPK通路蛋白及其磷酸化水平的改變細胞分組為:①持續(xù)染毒4天,組別為正常對照組、TDCPP 5μM、15μM、25μM、50μM組,以探究其蛋白磷酸化水平改變與TDCPP染毒的劑量效應關系;②以50μM TDCPP染毒,分別持續(xù)染毒1-6天,以探究其蛋白磷酸化水平改變與TDCPP染毒的時間效應關系。為確定Ca MK2與MAPK通路之間關系實驗細胞分組為正常對照組、正常對照+KN93處理組、25μM TDCPP染毒組、25μM TDCPP+KN93處理組、50μM TDCPP染毒組、50μM TDCPP+KN93處理組。KN93抑制劑使用濃度為10μM,前處理時間為1小時,實驗細胞連續(xù)染毒時間為6天。實驗結果顯示在TDCPP的作用下,PC12細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)受到破壞,隨著染毒劑量增加呈現細胞內Ca2+濃度水平增多的劑量效應關系,且隨著染毒時間的延長細胞內Ca2+濃度水平同樣呈現增多的趨勢。Ca MK2和MAPK通路蛋白磷酸化水平增加,其中Ca MK2的磷酸化呈現明顯的時間和劑量效應;JNK和p38蛋白磷酸化水平增多表現相似的變化趨勢,存在明顯的劑量效應;Erk1/2蛋白磷酸化水平增多則存在明顯的時間效應。另外TDCPP染毒的PC12細胞中,MAPK通路磷酸化水平增多可以被Ca MK2磷酸化抑制劑部分抑制,提示了MAPK信號通路與Ca MK2蛋白之間存在相互作用關系,暴露于TDCPP下的PC12細胞內MAPK信號通路部分被直接激活,部分由Ca MK2的磷酸化引起。由此,第二信使Ca2+、關鍵蛋白Ca MK2和MAPK信號通路蛋白的磷酸化水平的改變,可能成為典型有機磷酸酯類阻燃劑TDCPP暴露所致PC12細胞產生神經毒性效應的生物分子作用機制。綜上,可得出如下結論:TDCPP/TCEP可引起PC12細胞神經毒性,調節(jié)蛋白Ca MK2、GAP43和骨架蛋白tubulin、NF-H可能成為其重要的生物標志物,而信號通路參與調節(jié)其神經毒性,細胞內Ca2+濃度水平增多、Ca MK2磷酸化、MAPK信號通路激活可能成為TDCPP引起PC12細胞神經毒性的生物分子機制。本課題實驗研究結果將豐富以TDCPP/TCEP為典型有機磷酸酯類阻燃劑的神經毒性的基礎理論知識,并為OPFRs所致神經毒性評價提供了基礎數據支持。
【關鍵詞】：有機磷酸酯類阻燃劑 PC12細胞 鈣依賴性鈣調蛋白激酶2 促分裂原活化蛋白激酶
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R114
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-16
• 第一章 TDCPP/TCEP對PC12細胞的神經毒性效應16-24
• 1. 材料方法16-18
• 1.1 主要試劑16
• 1.2 材料儀器16-17
• 1.3 藥物/試劑配備17
• 1.4 細胞培養(yǎng)17-18
• 1.5 實驗方法18
• 2. 統(tǒng)計學處理18-19
• 3. 實驗結果19-23
• 3.1 TDCPP/TCEP對PC12細胞生存率的時間、劑量效應影響19-21
• 3.2 TDCPP/TCEP對PC12細胞形態(tài)的影響21
• 3.3 TDCPP對PC12細胞凋亡率的時間、劑量效應影響21-23
• 4. 討論分析23-24
• 第二章 TDCPP/TCEP引起PC12細胞神經毒性的蛋白生物標志物24-32
• 1. 材料方法24-27
• 1.1 主要試劑24-25
• 1.2 主要儀器25
• 1.3 細胞培養(yǎng)25
• 1.4 實驗方法25-27
• 2. 統(tǒng)計學處理27
• 3. 實驗結果27-30
• 3.1 TDCPP/TCEP對PC12細胞內Ca MK2、GAP43蛋白表達的影響27-28
• 3.2 TDCPP/TCEP對PC12細胞內tubulin、NF-H蛋白表達的影響28-30
• 4. 討論分析30-32
• 第三章 TDCPP引起PC12細胞神經毒性的生物分子機制32-51
• 1. 材料方法32
• 1.1 主要試劑32
• 1.2 儀器材料32
• 1.3 細胞培養(yǎng)32
• 2. 統(tǒng)計學處理32-33
• 第一節(jié) 鈣調通路參與TDCPP引起的PC12細胞神經毒性33-38
• 1. 實驗方法33
• 1.1 流式細胞儀檢測細胞內Ca2+濃度水平的改變33
• 1.2 WB檢測Ca MK2蛋白磷酸化水平的改變33
• 2. 實驗結果33-38
• 2.1 TDCPP對PC12細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)的影響33-35
• 2.2 TDCPP對PC12細胞Ca MK2蛋白磷酸化的影響35-38
• 第二節(jié) MAPK通路參與TDCPP引起的PC12細胞神經毒性38-46
• 1. 實驗方法38
• 2. 實驗結果38-46
• 2.1 TDCPP對PC12細胞JNK蛋白磷酸化的影響38
• 2.2 TDCPP對PC12細胞Erk1/2 蛋白磷酸化的影響38
• 2.3 TDCPP對PC12細胞p38蛋白磷酸化的影響38-46
• 第三節(jié) Ca MK2磷酸化部分活化MAPK通路46-51
• 1. 實驗方法46
• 2. 實驗結果46-51
• 2.1 Ca MK2磷酸化抑制對暴露于TDCPP的PC12細胞生存率影響46
• 2.2 Ca MK2磷酸化抑制對暴露于TDCPP的PC12細胞MAPK通路磷酸化影響46-51
• 討論分析51-54
• 總結與展望54-56
• 參考文獻56-63
• 文獻綜述63-70
• 參考文獻67-70
• 論著全文70-90
• 個人簡歷90-91
• 致謝91

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前2條

1 塔娜;房彥軍;郭小娟;林本成;張華山;田蕾;襲著革;;磷酸三(2-氯乙基)酯阻燃劑對稀有泩鯽的毒性的初步觀察[J];解放軍預防醫(yī)學雜志;2013年05期

2 郭衛(wèi)偉;常麗俊;丁勇;李歡;葛翠翠;王海洋;張勤麗;牛僑;;納米氧化鋁亞慢性染毒致小鼠神經細胞線粒體損傷機制[J];中國藥理學與毒理學雜志;2014年02期

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本文編號：761545