本文關(guān)鍵詞：甲基叔丁基醚細(xì)胞毒性作用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

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【摘要】：甲基叔丁基醚(methyl tert-butyl ether,MTBE)作為一類廣泛應(yīng)用于汽油添加劑的有機(jī)小分子,近年來的職業(yè)暴露和環(huán)境暴露日益增多。研究表明甲基叔丁基醚在細(xì)胞水平及整體動物水平對生物體產(chǎn)生毒性作用,其潛在的毒性和生物學(xué)效應(yīng)包括急性毒性、生殖毒性、遺傳毒性、致癌性、細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激等,但其毒性作用機(jī)制不明。本研究結(jié)合毒理學(xué)研究方法和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),探討MTBE誘導(dǎo)中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細(xì)胞的氧化應(yīng)激效應(yīng)和蛋白質(zhì)組的改變,在分子水平探討MTBE的潛在毒性作用。本論文主要開展了以下兩部分的研究工作:1.MTBE對CHO細(xì)胞的體外毒性作用及氧化應(yīng)激效應(yīng)培養(yǎng)CHO細(xì)胞,使用不同濃度(0~100 mmol/L)的MTBE處理CHO細(xì)胞6h、12h、24h,MTT法觀察細(xì)胞的增殖抑制作用,確定MTBE作用CHO細(xì)胞劑量-效應(yīng)關(guān)系。設(shè)置空白對照組,以0.5 mmol/L、5.0 mmol/L、25.0 mmol/L、50.0 mmol/L和100 mmol/L為處理組,處理時間均為12 h,用試劑盒檢測乳酸脫氫酶(LDH)漏出、丙二醛(MDA)含量、活性氧(ROS)生成量及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力等氧化應(yīng)激相關(guān)各項指標(biāo),同時運用熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測氧化應(yīng)激相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn):處理后的CHO細(xì)胞,其存活率下降,并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系;同時LDH漏出,MDA含量都隨MTBE劑量的增大而升高,且呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系,但ROS生成量卻隨MTBE劑量的增大而降低,SOD、CAT及GSH酶活力都呈升高趨勢。此外,隨著MTBE濃度的升高,SOD1、CAT、GPX-1的基因和蛋白表達(dá)水平與對照組相比都有不同程度的升高。這一結(jié)果也與前期的相關(guān)酶活力的變化趨勢呈現(xiàn)很好的一致性。因此,MTBE暴露可以抑制CHO細(xì)胞增殖并引起氧化應(yīng)激效應(yīng),提示氧化應(yīng)激效應(yīng)可能參與MTBE致CHO細(xì)胞的毒性作用。2.MTBE致CHO細(xì)胞毒性作用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究參考確定的劑量-效應(yīng)關(guān)系,MTBE暴露以0 mmol/L、5.0 mmol/L和100.0mmol/L 3個劑量對CHO細(xì)胞進(jìn)行12 h處理,制備蛋白樣品進(jìn)行熒光差異凝膠電泳(2D-DIGE),對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,再使用Western blot對差異蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。研究發(fā)現(xiàn):通過2D-DIGE和MALDI-TOF-MS/MS質(zhì)譜技術(shù),測定了在MTBE處理下CHO細(xì)胞蛋白質(zhì)組的差異表達(dá),共鑒定出24個蛋白,與對照組相比,有16個蛋白的表達(dá)上調(diào),8個蛋白的表達(dá)下調(diào)。對這些差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,篩選出4個與細(xì)胞毒性以及氧化應(yīng)激相關(guān)的蛋白分子,分別為:Stress-70 protein,mitochondrial(GRP75)、Heat shock cognate 71 kDa protein(HSC70)、40S ribosomal protein SA(RPSA)和Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase(PPIA),通過Westernblot進(jìn)行蛋白驗證,其表達(dá)變化情況與CHO細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的實驗結(jié)果相符合。因此,MTBE暴露可以誘導(dǎo)CHO細(xì)胞蛋白表達(dá)水平的變化,這些氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平的改變可能是MTBE致CHO細(xì)胞毒性作用的重要組成部分。
【關(guān)鍵詞】：甲基叔丁基醚 CHO細(xì)胞 氧化應(yīng)激 蛋白質(zhì)組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：湘潭大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R114
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 緒論11-21
• 1.1 MTBE的物理化學(xué)性質(zhì)11-12
• 1.2 MTBE的毒理學(xué)研究12-14
• 1.2.1 MTBE的急性毒性12
• 1.2.2 MTBE的遺傳毒性12-13
• 1.2.3 MTBE的致癌性13
• 1.2.4 MTBE的生殖毒性13-14
• 1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在毒理學(xué)中的應(yīng)用14-17
• 1.3.1 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)概述14-16
• 1.3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在毒理學(xué)研究中的應(yīng)用16-17
• 1.4 課題研究基礎(chǔ)17-18
• 1.4.1 MTBE在不同細(xì)胞系中的毒性研究情況17
• 1.4.2 本課題組在蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用研究基礎(chǔ)17-18
• 1.5 課題研究目的及實驗方案18-21
• 1.5.1 課題研究目的及意義18
• 1.5.2 研究內(nèi)容18-19
• 1.5.3 實驗設(shè)計方案及技術(shù)路線19-21
• 第二章 MTBE誘導(dǎo)CHO細(xì)胞毒性作用和氧化應(yīng)激效應(yīng)21-44
• 2.1 前言21
• 2.2 實驗材料21-24
• 2.2.1 主要儀器21-22
• 2.2.2 主要試劑22-23
• 2.2.3 細(xì)胞及受試物23
• 2.2.4 培養(yǎng)基及常用溶液配置23-24
• 2.3 實驗方法24-33
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理24
• 2.3.2 細(xì)胞增殖試驗24
• 2.3.3 LDH漏出率檢測24-25
• 2.3.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧的檢測25-26
• 2.3.5 丙二醛含量的檢測26
• 2.3.6 氧化應(yīng)激相關(guān)酶活力的檢測26-28
• 2.3.7 特定基因的mRNA表達(dá)檢測28-31
• 2.3.8 相關(guān)蛋白表達(dá)檢測31-33
• 2.4 結(jié)果33-41
• 2.4.1 細(xì)胞增殖抑制作用33-34
• 2.4.2 細(xì)胞形態(tài)變化34-35
• 2.4.3 LDH漏出率檢測35
• 2.4.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧的檢測35-36
• 2.4.5 丙二醛（MDA）含量的檢測36
• 2.4.6 氧化應(yīng)激相關(guān)酶活力的檢測36-38
• 2.4.7 熒光定量PCR38-40
• 2.4.8 MTBE對蛋白表達(dá)的影響40-41
• 2.5 討論41-43
• 2.6 本章小結(jié)43-44
• 第3章 MTBE對CHO細(xì)胞蛋白質(zhì)組的影響44-69
• 3.1 前言44
• 3.2 實驗材料44-46
• 3.2.1 主要儀器44-45
• 3.2.2 主要試劑45-46
• 3.2.3 細(xì)胞及受試物46
• 3.2.4 培養(yǎng)基及常用溶液配置46
• 3.3 實驗方法46-52
• 3.3.1 CHO細(xì)胞染毒處理46
• 3.3.2 蛋白提取及處理46-47
• 3.3.3 蛋白定量47
• 3.3.4 熒光標(biāo)記47-49
• 3.3.5 第一向等點聚焦49-50
• 3.3.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）50-51
• 3.3.7 二維凝膠熒光圖像分析51
• 3.3.8 后染色（post-stained）的制備凝膠電泳51
• 3.3.9 挖點及蛋白酶解51-52
• 3.3.10 質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫搜索52
• 3.3.11 差異表達(dá)蛋白的Western blot驗證52
• 3.4 結(jié)果52-66
• 3.4.1 蛋白定量結(jié)果52-53
• 3.4.2 2D-DIGE分析53-55
• 3.4.3 差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜鑒定55-63
• 3.4.4 差異蛋白的功能分析63-64
• 3.4.5 差異蛋白的Western blot驗證64-66
• 3.5 討論66-67
• 3.6 本章小結(jié)67-69
• 第四章 結(jié)論與展望69-71
• 4.1 結(jié)論69
• 4.2 展望69-71
• 參考文獻(xiàn)71-77
• 致謝77-78
• 附錄 英文縮略詞表78-79
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文79

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