本文關(guān)鍵詞：甲基乙二醛誘導(dǎo)EA.hy926細胞線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放的機制

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【摘要】：甲基乙二醛(Methylglyoxal,MGO)是一種內(nèi)源性代謝的活性羰基化合物,易與蛋白質(zhì)的氨基酸殘基反應(yīng)生成晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end products,AGEs),可以誘導(dǎo)細胞羰基應(yīng)激和氧化應(yīng)激,導(dǎo)致細胞損傷。MGO以及AGEs的積累在糖尿病血管并發(fā)癥、腎病等疾病中起到關(guān)鍵作用,抑制MGO的細胞毒性對以上疾病的防控尤為重要。MGO的細胞毒性機制主要是AGEs-RAGE(AGEs receptor),促進活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成,誘導(dǎo)線粒體損傷和細胞凋亡,但對于細胞凋亡的機制尚未詳細闡述。線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)開放在線粒體依賴的細胞凋亡中起到關(guān)鍵,但MGO能否誘導(dǎo)mPTP及其機制尚不清楚。糖原合酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)是目前調(diào)控mPTP的重要調(diào)節(jié)蛋白,被激活后可以誘導(dǎo)線粒體膜上的己糖激酶II(HexokinaseII,HKII)從線粒體脫離而引起mPTP開放。本研究將以EA.hy926細胞為模型,以線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔為靶點,從AGEs-RAGE、氧化應(yīng)激闡述MGO引起的細胞毒性機制。結(jié)果如下:1.通過3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)、臺盼藍染色法檢測MGO的細胞毒性,羅丹明123檢測線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential,MMP)變化、DCFH-DA探針檢測ROS、線粒體基質(zhì)腫脹、流式細胞儀檢測細胞凋亡,探討MGO引起細胞毒性的機制。結(jié)果顯示隨著MGO濃度的增加,細胞活力降低,細胞毒性增強,線粒體MMP降低、細胞ROS增加、線粒體基質(zhì)腫脹、細胞凋亡,且都呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。而且加入羰基捕獲劑氨基胍(Aminoguanidine,AG)、活性氧抑制劑4-Hydroxy-TEMPO(TEMPOL)以及GSK3β抑制劑SB216763、LiCl,均可顯著抑制MGO的這種作用。2.Westren blot檢測細胞內(nèi)非熒光AGEs羧甲基賴氨酸(N-ε-carboxymethyl-lysine,CML)及其受體RAGE、GSK3β激酶9位絲氨酸磷酸化的蛋白水平以及HKII在線粒體內(nèi)的蛋白水平表達。結(jié)果顯示隨著MGO濃度的增加,CML、RAGE蛋白表達水平顯著增加,而羰基捕獲劑AG、活性氧抑制劑TEMPOL顯著抑制MGO誘導(dǎo)的CML、RAGE蛋白表達水平的增加;相反,隨著MGO濃度的增加,GSK3β激酶9位絲氨酸磷酸化蛋白表達水平顯著減少,但此蛋白表達水平的減少可被AG、TEMPOL和GSK3β抑制劑SB216763顯著抑制;0.5 mM和1 mM MGO引起線粒體內(nèi)HKII蛋白水平表達顯著減少,而羰基捕獲劑AG、活性氧抑制劑TEMPOL以及GSK3β抑制劑SB216763和LiCl顯著抑制MGO引起的線粒體內(nèi)HKII蛋白水平表達顯著減少。綜上所述,MGO引起EA.hy926細胞毒性,其毒性機制可能與線粒體損傷、細胞凋亡相關(guān)。進一步實驗證明MGO引起細胞凋亡的毒性機制與線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔有關(guān),可能的機制是(1)MGO通過CML-RAGE通路激活GSK3β作用于線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔;(2)MGO誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激作用于GSK3β而誘導(dǎo)線粒體膜通透性改變;(3)MGO誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激直接調(diào)控mPTP。
【關(guān)鍵詞】：甲基乙二醛 線粒體功能障礙 細胞凋亡 mPTP GSK3β
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R114
【目錄】：

• 摘要6-8
• abstract8-13
• 文獻綜述13-27
• 第一章 MGO細胞毒性機制的研究進展13-27
• 1.1 MGO的來源與代謝13-15
• 1.1.1 MGO體內(nèi)和體外來源13
• 1.1.2 MGO的體內(nèi)代謝途徑13-15
• 1.2 MGO與羰基應(yīng)激15-17
• 1.2.1 羰基應(yīng)激的發(fā)生及其毒性作用15
• 1.2.2 AGEs的形成及其毒性作用15-16
• 1.2.3 MGO誘導(dǎo)羰基應(yīng)激和AGEs的形成16-17
• 1.3 MGO與氧化應(yīng)激17-19
• 1.3.1 氧化應(yīng)激的產(chǎn)生及其毒性作用17-18
• 1.3.2 MGO誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致細胞毒性18-19
• 1.3.2.1 MGO誘導(dǎo)一氧化氮合成酶產(chǎn)生氧化應(yīng)激18
• 1.3.2.2 MGO通過MAPK信號通路產(chǎn)生氧化應(yīng)激18
• 1.3.2.3 MGO激活MEK/ERK信號通路產(chǎn)生氧化應(yīng)激18
• 1.3.2.4 MGO激活NADPH氧化酶產(chǎn)生氧化應(yīng)激18
• 1.3.2.5 MGO通過AGEs/RAGE誘導(dǎo)氧化應(yīng)激18-19
• 1.4 MGO與細胞凋亡19-20
• 1.4.1 細胞凋亡途徑19
• 1.4.2 MGO誘導(dǎo)的細胞凋亡19-20
• 1.5 線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)與細胞凋亡20-24
• 1.5.1 mPTP的結(jié)構(gòu)與功能20-23
• 1.5.1.1 mPTP的發(fā)現(xiàn)以及組成結(jié)構(gòu)20-22
• 1.5.1.2 mPTP的生理功能22-23
• 1.5.2 mPTP開放與細胞凋亡23
• 1.5.3 mPTP開放的誘導(dǎo)因素23-24
• 1.6 糖原合酶激酶 3β 調(diào)控mPTP研究進展24-26
• 1.6.1 GSK3β 激酶活性及功能24
• 1.6.2 GSK3β 調(diào)節(jié)mPTP的機制24-26
• 1.7 研究假設(shè)26-27
• 試驗研究27-48
• 第二章 甲基乙二醛誘導(dǎo)EA.hy926細胞線粒體功能障礙27-37
• 2.1 試驗材料及儀器27-28
• 2.1.1 材料27
• 2.1.2 試驗主要試劑及配制27-28
• 2.1.3 試驗儀器28
• 2.2 試驗方法28-31
• 2.2.1 EA.hy926細胞的培養(yǎng)28-29
• 2.2.1.1 EA.hy926細胞的復(fù)蘇28-29
• 2.2.1.2 EA.hy926細胞的傳代29
• 2.2.1.3 EA.hy926細胞的凍存29
• 2.2.2 細胞毒性的測定29-30
• 2.2.2.1 MTT法測定MGO對EA.hy926的細胞活力29
• 2.2.2.2 臺盼藍法檢測細胞毒性29-30
• 2.2.3 羅丹明 123（Rh123）熒光探針法檢測線粒體膜電位（MMP）30
• 2.2.4 線粒體腫脹檢測30
• 2.2.4.1 線粒體提取及完整性鑒定30
• 2.2.4.2 線粒體腫脹檢測30
• 2.2.5 DCFH-DA熒光探針法測定細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平30-31
• 2.2.6 細胞凋亡檢測31
• 2.2.7 數(shù)據(jù)分析31
• 2.3 試驗結(jié)果31-35
• 2.3.1 MGO對EA.hy926細胞毒性31-32
• 2.3.2 MGO對線粒體膜電位（MMP）的影響32
• 2.3.3 MGO誘導(dǎo)線粒體基質(zhì)腫脹32-33
• 2.3.4 MGO誘導(dǎo)EA.hy926細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激33-34
• 2.3.5 MGO誘導(dǎo)EA.hy926細胞凋亡34-35
• 2.4 討論35-36
• 2.5 小結(jié)36-37
• 第三章 甲基乙二醛通過AGEs-RAGE/GSK3β 途徑調(diào)節(jié)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）37-48
• 3.1 材料37-38
• 3.1.1 主要試劑及配制37-38
• 3.1.2 試驗儀器38
• 3.2 試驗方法38-40
• 3.2.1 Western blot檢測相關(guān)蛋白38-39
• 3.2.2.1 細胞全蛋白的提取38
• 3.2.2.2 線粒體蛋白提取38-39
• 3.2.2.3 Western blot檢測蛋白39
• 3.2.2 MTT法測定三類抑制劑對MGO引起EA.hy926細胞毒性的影響39
• 3.2.3 羅丹明 123（Rh123）熒光探針法檢測線粒體膜電位（MMP）39
• 3.2.4 線粒體腫脹檢測39
• 3.2.5 DCFH-DA熒光探針法測定細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平39
• 3.2.6 細胞凋亡檢測39-40
• 3.2.7 數(shù)據(jù)分析40
• 3.3 試驗結(jié)果40-45
• 3.3.1 MGO對CML和RAGE蛋白表達的影響40
• 3.3.2 MGO對GSK3β 蛋白磷酸化的影響40-41
• 3.3.3 MGO對HKII結(jié)合線粒體的影響41
• 3.3.4 三類抑制劑對MGO引起的細胞活力、MMP、ROS的影響41-42
• 3.3.5 三類抑制劑對MGO引起細胞凋亡的影響42-43
• 3.3.6 三類抑制劑對MGO引起的CML和RAGE表達增加的作用43-44
• 3.3.7 三類抑制劑對MGO引起的HKII脫離線粒體的影響44
• 3.3.8 三類抑制劑對MGO引起GSK3β 磷酸化減少的影響44-45
• 3.4 討論45-47
• 3.5 小結(jié)47-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻49-59
• 縮略詞59-61
• 致謝61-62
• 作者簡介62

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本文編號：735605