本文關(guān)鍵詞：γ-氨基丁酸對RIN-m5f細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制探究

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【摘要】：目的：氧化應(yīng)激被認(rèn)為是糖尿病發(fā)生和發(fā)展過程中的一種主要風(fēng)險因素。GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。研究證實，胰島β細(xì)胞分泌大量GABA，，對維護(hù)胰島β細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和胰島素分泌功能具有重要調(diào)節(jié)作用，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本研究擬建立高糖（G）和H2O2氧化損傷RIN-m5f細(xì)胞模型，以探討GABA對胰島β細(xì)胞抗氧化調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制。 方法：分別采用11mM、22mM、44mM G孵育RIN-m5f細(xì)胞48h，以及10μM、50μM、100μM H2O2孵育1h建立體外氧化損傷細(xì)胞模型。GABA干預(yù)實驗分為：對照組（11mM G）、損傷組（G/H2O2）、GABA組（G/H2O2+GABA）、硫辛酸組（G/H2O2+LA）。采用DCFH-DA熒光探針法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平；檢測細(xì)胞氧化還原狀態(tài)指標(biāo)和胰島素分泌水平；MTT法測定細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡線粒體膜電位；RT-PCR法檢測與抗氧化、抗凋亡和胰島素分泌相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平；Western blot法檢測Nrf2和GSK-3β蛋白水平、p-GSK-3β（Ser9）和p-GSK-3β（Tyr216）磷酸化水平。 結(jié)果：隨著G和H2O2濃度的增加，胞內(nèi)ROS和MDA水平顯著提高（P0.05），且GAD1mRNA表達(dá)水平極顯著下調(diào)（P0.01），細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的氧化損傷（P0.05）；添加100μM和200μM GABA可顯著降低胞內(nèi)ROS和MDA水平（P0.05），提高T-AOC、GSH-Px、CAT、SOD活力，上調(diào)抗氧化及抗凋亡相關(guān)基因Nrf2、NQO1、HO-1、Bcl-2mRNA表達(dá)水平（P0.05），提高細(xì)胞線粒體膜電位和存活率（P0.05）；此外，GABA可顯著提高胰島素合成相關(guān)基因（INS-2、Pdx-1、MafA、GK、GLUT2、Gabra2）mRNA表達(dá)水平（P0.05），促進(jìn)胰島素分泌釋放；Western blot結(jié)果顯示，GABA顯著抑制氧化損傷細(xì)胞（44mM G和100μM H2O2）GSK-3β蛋白水平（P0.05），顯著提高p-GSK-3β（Ser9）磷酸化水平和Nrf2核質(zhì)比例（P0.05），但對p-GSK-3β（Tyr216）磷酸化水平無顯著性影響（P0.05）。 結(jié)論：GABA可顯著增強(qiáng)氧化損傷（G和H2O2）RIN-m5f細(xì)胞抗氧化能力，提高細(xì)胞存活率和胰島素合成分泌，具有抗凋亡作用；GABA可調(diào)節(jié)胞內(nèi)GSK-3β/Nrf2通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平，顯著提高Nrf2核質(zhì)比例，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，其作用機(jī)制可能與提高p-GSK-3β (Ser9)磷酸化水平、降低GSK-3β蛋白水平有關(guān)；GABA抗氧化調(diào)節(jié)作用具有濃度依賴效應(yīng)，即隨著氧化損傷程度的增加，GABA需要量增加。
【關(guān)鍵詞】：GABA 抗氧化 抗凋亡 胰島素分泌 RIN-m5f細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R151.2
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-5
• 中英文縮略語對照表5-6
• 目錄6-8
• 一 引言8-17
• 1.1 糖尿病概述8-9
• 1.2 糖尿病與氧化應(yīng)激9
• 1.2. 氧化應(yīng)激概述9-12
• 1.2.2 氧化應(yīng)激與糖尿病9-11
• 1.2.3 GSK-3β/Nrf2 信號通路與胰島β細(xì)胞功能11-12
• 1.3 γ-氨基丁酸（Gamma-AminobutyricAcid，GABA）及其研究進(jìn)展12-14
• 1.3.1 GABA 概述12-13
• 1.3.2 GABA 與胰腺的相關(guān)研究13-14
• 1.3.3 GABA 抗氧化調(diào)節(jié)作用14
• 1.4 立題意義及研究內(nèi)容14-17
• 二 材料與方法17-24
• 2.1 材料與儀器17
• 2.1.1 主要實驗原料及試劑17
• 2.1.2 實驗儀器17
• 2.2 實驗方法17-24
• 2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)溶液配制17-18
• 2.2.2 RIN-m5f 細(xì)胞培養(yǎng)18
• 2.2.3 H_2O_2氧化損傷模型和高糖氧化損傷模型的建立18
• 2.2.4 GABA 對 H_2O_2和高糖誘導(dǎo)氧化損傷 RIN-m5f 細(xì)胞保護(hù)濃度的選擇18-19
• 2.2.5 MTT 法檢測細(xì)胞存活率19
• 2.2.6 DCFH-DA 熒光探針法檢測細(xì)胞內(nèi)自由基 ROS 水平19
• 2.2.7 氧化還原指標(biāo)（抗氧化酶活力和 MDA 含量）的測定19
• 2.2.8 測定細(xì)胞凋亡線粒體膜電位（△ψ）19
• 2.2.9 胰島素分泌測定19-20
• 2.2.10 實時熒光定量 PCR 檢測基因 mRNA 水平20-21
• 2.2.11 Western Blot 檢測蛋白表達(dá)21-23
• 2.2.12 統(tǒng)計學(xué)處理23-24
• 三 結(jié)果與討論24-48
• 3.1 高糖氧化損傷模型和 H_2O_2氧化損傷模型的建立24-25
• 3.1.1 高糖誘導(dǎo) RIN-m5f 細(xì)胞氧化損傷模型的建立24
• 3.1.2 建立 RIN-m5f 細(xì)胞 H_2O_2氧化損傷模型24-25
• 3.2 GABA 對高糖和 H_2O_2氧化損傷 RIN-m5f 細(xì)胞的抗氧化調(diào)節(jié)作用研究25-30
• 3.2.1 GABA 對高糖和 H_2O_2氧化損傷 RIN-m5f 細(xì)胞 ROS 水平的影響25-26
• 3.2.2 GABA 對高糖和 H_2O_2氧化損傷 RIN-m5f 細(xì)胞氧化還原指標(biāo)的影響26-29
• 3.2.3 GABA 對高糖和 H_2O_2氧化損傷RIN-m5f細(xì)胞抗氧化相關(guān)基因mRNA水平的影響29-30
• 3.3 GABA 對高糖和 H_2O_2氧化損傷 RIN-m5f 細(xì)胞的抗凋亡作用探究30-36
• 3.3.1 GABA 對高糖和 H_2O_2氧化損傷 RIN-m5f 細(xì)胞凋亡線粒體膜電位的影響31-32
• 3.3.2 GABA 對高糖和 H_2O_2氧化損傷 RIN-m5f 細(xì)胞存活率的影響32-34
• 3.3.3 GABA 對高糖和 H_2O_2氧化損傷RIN-m5f細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA水平的影響34-36
• 3.4 GABA 對高糖和 H_2O_2氧化損傷 RIN-m5f 細(xì)胞胰島素分泌功能的影響36-40
• 3.4.1 GABA 對高糖和 H_2O_2氧化損傷 RIN-m5f 細(xì)胞胰島素分泌量的影響36-37
• 3.4.2 GABA 對高糖和 H_2O_2氧化損傷 RIN-m5f 細(xì)胞與胰島素分泌相關(guān)基因的影響37-40
• 3.5 GABA 對高糖和 H_2O_2氧化損傷 RIN-m5f 細(xì)胞保護(hù)通路的探究40-48
• 3.5.1 高糖和 H_2O_2氧化損傷對 GAD 的影響40-42
• 3.5.2 GABA 對高糖和 H_2O_2氧化損傷 RIN-m5f 細(xì)胞 Akt/GSK-3β通路相關(guān)基因的影響42-43
• 3.5.3 GABA 對高糖和 H_2O_2氧化損傷 RIN-m5f 細(xì)胞 GSK-3β蛋白表達(dá)及其磷酸化水平的影響43-46
• 3.5.6 GABA 對高糖和 H_2O_2氧化損傷 RIN-m5f 細(xì)胞 Nrf2 核質(zhì)比的影響46-48
• 主要結(jié)論與展望48-49
• 主要結(jié)論48
• 展望48-49
• 致謝49-50
• 參考文獻(xiàn)50-56
• 附錄: 作者在攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文56

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：710209