本文關(guān)鍵詞：納米氧化銅對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞毒性及其機(jī)理研究

  更多相關(guān)文章： 納米氧化銅 HepG2細(xì)胞 活性氧(ROS) DNA損傷 蛋白質(zhì)羰基化(PC) 脂質(zhì)過(guò)氧化(MDA) 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞周期阻滯

【摘要】：伴隨納米科技的迅猛發(fā)展,多種納米材料被廣泛應(yīng)用,逐步進(jìn)入到周圍環(huán)境及生命體中,納米材料的生物安全性及生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)研究逐漸成為研究關(guān)注的熱點(diǎn)。納米氧化銅(CuO NPs)因具有良好的殺菌性、催化特性和熱穩(wěn)定性,而被廣泛應(yīng)用于涂料、廢水處理、殺菌以及生物醫(yī)用陶瓷材料等領(lǐng)域。細(xì)胞作為機(jī)體基本的結(jié)構(gòu)與功能單位,其試驗(yàn)周期短、特異性高、易于培養(yǎng),應(yīng)用于揭示外來(lái)物質(zhì)的致毒機(jī)理。本文以人肝癌細(xì)胞(HepG2)作為受試對(duì)象,系統(tǒng)探究了CuO NPs對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性作用及分子機(jī)理。初步獲得了以下幾個(gè)結(jié)論：1.不同濃度CuO NPs對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性效應(yīng)研究結(jié)果顯示,CuO NPs16h的IC50為8mg/L,同時(shí)隨處理時(shí)間的增長(zhǎng),細(xì)胞活性明顯降低。說(shuō)明CuO NPs可抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖,具有細(xì)胞毒性,呈時(shí)間—?jiǎng)┝恳蕾囆?yīng)。2.為了進(jìn)一步明確CuO NPs對(duì)Hep(G2細(xì)胞的毒性作用機(jī)理,研究了不同濃度C uO NPs對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、蛋白質(zhì)羰基化、DNA損傷以及細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)含量水平的影響。結(jié)果表明,HepG2細(xì)胞暴露于CuO NPs后,脂質(zhì)過(guò)氧化(MDA)水平及蛋白質(zhì)羰基化(PC)水平隨CuO NPs濃度的增加而逐漸增大。CuO NPs可導(dǎo)致DNA彗尾的遷移距離顯著上升,說(shuō)明其誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生DNA斷裂損傷；CuO NPs可誘導(dǎo)DNA產(chǎn)生堿基修飾,從而生成8-OHdG,產(chǎn)生DNA氧化損傷,上述結(jié)果說(shuō)明CuO NPs具有遺傳毒性。同時(shí),細(xì)胞內(nèi)ROS水平呈爆發(fā)式增長(zhǎng)。本研究利用ROS清除劑NAC進(jìn)行反向驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,NAC可清除過(guò)量的ROS從而對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子起到保護(hù)作用。結(jié)果證實(shí)了活性氧(ROS)是CuO NPs引起HepG2細(xì)胞損傷作用的關(guān)鍵因素。3.利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期的定量檢測(cè),結(jié)果顯示CuO NPs濃度的增加使得HepG2細(xì)胞周期阻滯更加顯著,細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK表達(dá)量隨CuONPs濃度增加而上升,cyclin表達(dá)量隨CuO NPs濃度增加而下降,證實(shí)HepG2細(xì)胞周期被陽(yáng)滯干S期。采用流式細(xì)胞儀雙染色法檢測(cè)顯示CuO NPs可劑量依賴性地誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的ROS可造成線粒體膜位電勢(shì)(Δφpm)下降,引起線粒體去極化。通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)量的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),CuO NPs處理后的HepG2細(xì)胞的Caspase-3及C aspase-9兩個(gè)基因的表達(dá)量上升,提示由線粒體介導(dǎo)的Caspases活化級(jí)聯(lián)形式是C uO NP s誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡的重要通路。上述結(jié)果表明,CuO NPs可以抑制HepG2細(xì)胞增殖,對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷作用；同時(shí)CuO NPs可引起細(xì)胞周期阻滯并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其機(jī)制與ROS誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：納米氧化銅 HepG2細(xì)胞 活性氧(ROS) DNA損傷 蛋白質(zhì)羰基化(PC) 脂質(zhì)過(guò)氧化(MDA) 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞周期阻滯
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R114
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第1章 緒論13-23
• 1.1 納米材料簡(jiǎn)介13-18
• 1.1.1 納米材料的分類13-15
• 1.1.1.1 碳NPs13-14
• 1.1.1.2 金屬氧化物類NPs14
• 1.1.1.3 非金屬氧化物NPs14
• 1.1.1.4 金屬NPs14
• 1.1.1.5 量子點(diǎn)(QDs)14-15
• 1.1.2 納米材料的特性15-16
• 1.1.2.1 小尺寸效應(yīng)15
• 1.1.2.2 表面效應(yīng)15
• 1.1.2.3 體積效應(yīng)15-16
• 1.1.2.4 量子尺寸效應(yīng)16
• 1.1.2.5 宏觀量子隧道效應(yīng)16
• 1.1.3 納米材料的應(yīng)用16-18
• 1.1.3.1 催化劑材料16-17
• 1.1.3.2 傳感器材料17
• 1.1.3.3 生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用17-18
• 1.1.3.4 環(huán)保領(lǐng)域的應(yīng)用18
• 1.2 納米材料毒性研究進(jìn)展18-20
• 1.2.1 納米材料的抗菌活性18
• 1.2.2 納米材料的植物毒性18-19
• 1.2.3 納米材料的動(dòng)物毒性19-20
• 1.2.4 納米材料的細(xì)胞毒性20
• 1.3 研究背景、意義及技術(shù)路線20-23
• 1.3.1 研究背景20-21
• 1.3.2 研究目的和意義21-22
• 1.3.3 研究技術(shù)路線22-23
• 第2章 CuO NPs的表征及分散于培養(yǎng)基中的基本性質(zhì)23-29
• 2.1 引言23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料23-24
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法24-25
• 2.3.1 懸浮液配制24
• 2.3.2 粒徑測(cè)定24
• 2.3.3 表面積測(cè)定24
• 2.3.4 XRD表征24
• 2.3.5 CuO NPs懸浮液Zeta電位的測(cè)定24
• 2.3.6 CuO NPs釋放Cu~(2+)含量測(cè)定24-25
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-28
• 2.4.1 納米CuO的基本理化性質(zhì)25-26
• 2.4.2 納米CuO在培養(yǎng)基及水中的性質(zhì)對(duì)比26-27
• 2.4.3 CuO NPs釋放Cu~(2+)含量測(cè)定27-28
• 2.5 本章小結(jié)28-29
• 第3章 CuO NPs對(duì)HepG2細(xì)胞的損傷作用及致毒機(jī)理29-53
• 3.1 引言29-30
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料30-31
• 3.2.1 細(xì)胞株30
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑30
• 3.2.3 溶液配制30-31
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法31-42
• 3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)31-32
• 3.3.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性及IC_(50)的測(cè)定32-33
• 3.3.3 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物損傷(MDA)的測(cè)定33-36
• 3.3.4 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)羰基化的測(cè)定36-37
• 3.3.5 細(xì)胞DNA氧化損傷檢測(cè)37-41
• 3.3.5.1 單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)實(shí)驗(yàn)38-39
• 3.3.5.2 細(xì)胞內(nèi)8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷(8-OHdG)免疫組化分析39-41
• 3.3.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧類(ROS)的測(cè)定41
• 3.3.7 NAC對(duì)納米CuO所致HepG2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用41-42
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-49
• 3.4.1 CuO NPs抑制HepG2細(xì)胞增殖及NAC干預(yù)作用42-43
• 3.4.2 CuO NPs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)MDA含量升高及NAC干預(yù)作用43-44
• 3.4.3 CuO NPs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)PC含量升高及NAC干預(yù)作用44-45
• 3.4.4 CuO NPs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞DNA鏈斷裂及NAC干預(yù)作用45-46
• 3.4.5 CuO NPs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)8-OHdG含量升高及NAC干預(yù)作用46-47
• 3.4.6 CuO NPs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高及NAC干預(yù)作用47-49
• 3.5 討論49-53
• 第4章 CuO NPs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡作用機(jī)制53-71
• 4.1 引言53-54
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料54
• 4.2.1 細(xì)胞株54
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)藥品54
• 4.2.3 溶液配制54
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法54-62
• 4.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)54-55
• 4.3.2 納米CuO誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞周期阻滯55-59
• 4.3.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期阻滯55-56
• 4.3.2.2 細(xì)胞RNA的提取56
• 4.3.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)56-59
• 4.3.2.3.1 反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA56-57
• 4.3.2.3.2 引物的設(shè)計(jì)57
• 4.3.2.3.3 Real-time PCR的反應(yīng)體系57-58
• 4.3.2.3.4 Real-time PCR的反應(yīng)程序58
• 4.3.2.3.5 結(jié)果分析58-59
• 4.3.3 納米CuO誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡59-62
• 4.3.3.1 JC-1染色檢測(cè)線粒體膜位電勢(shì)△φ_m59
• 4.3.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡59-61
• 4.3.3.3 細(xì)胞RNA的提取61
• 4.3.3.4 熒光定量PCR檢測(cè)61-62
• 4.3.3.4.1 反轉(zhuǎn)錄第一條鏈cDNA61
• 4.3.3.4.2 引物的設(shè)計(jì)61-62
• 4.3.3.4.3 Real-time PCR的反應(yīng)體系62
• 4.3.3.4.4 Real-time PCR的反應(yīng)程序62
• 4.3.3.4.5 結(jié)果分析62
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果62-67
• 4.4.1 CuO NPs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞周期阻滯62-64
• 4.4.2 CuO NPs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡64-67
• 4.5 討論67-71
• 第5章 結(jié)論、創(chuàng)新之處和研究展望71-74
• 5.1 主要結(jié)論71-73
• 5.1.1 活性氧(ROS)是CuO NPs引起HepG2細(xì)胞損傷作用的關(guān)鍵因素71-72
• 5.1.2 CuO NPs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞周期阻滯72
• 5.1.3 CuO NPs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的途徑是由線粒體所接到的Caspase途徑72-73
• 5.2 創(chuàng)新之處73
• 5.3 研究展望73-74
• 參考文獻(xiàn)74-87
• 致謝87-88
• 攻讀碩士學(xué)位期間取得研究成果88-89
• 附錄Ⅰ 文中主要縮略語(yǔ)中英文對(duì)照表89-91
• 附錄Ⅱ 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備91

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：706623