本文關鍵詞：小膠質細胞誘導星形膠質細胞功能改變在鉛錳聯(lián)合暴露致認知功能損傷中的作用及機制

  更多相關文章： 鉛 錳 小膠質細胞 星形膠質細胞 谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán) 學習記憶

【摘要】：近年來,隨著我國快速工業(yè)化和城市進程的發(fā)展,環(huán)境污染問題越來越受到人們的關注。鉛、錳等重金屬污染物造成機體多系統(tǒng)及器官損傷,尤其是神經(jīng)系統(tǒng)損傷的不可逆性逐漸成為人們關注及研究的熱點。以往對鉛、錳等重金屬的研究多集中于其單一毒性效應而忽視了其聯(lián)合暴露效應及機制的研究。而任何一個個體的生存環(huán)境都是一個復雜的復合暴露環(huán)境,研究重金屬污染物對機體的損害必需考慮到其聯(lián)合暴露的毒性機制。星形膠質細胞(astrocyte,AS)在腦內分布極為廣泛,主要起支持和分隔神經(jīng)細胞的作用。近年來研究還證實AS在調節(jié)細胞外神經(jīng)遞質方面發(fā)揮著重要的作用,尤其是對興奮性氨基酸—谷氨酸(glutamic acid,Glu)的調節(jié)。而谷氨酸在細胞外的蓄積被認為是產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性的主要原因。小膠質細胞(microglia,MG)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)的免疫駐留細胞,許多研究發(fā)現(xiàn)在生理及病理狀態(tài)下,MG都可以對AS發(fā)揮調控作用。研究發(fā)現(xiàn)低劑量鉛(lead,Pb)能引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷,同時鉛暴露可以誘導不同發(fā)育階段仔鼠大腦海馬中谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)、谷氨酸轉運體谷氨酸-胱氨酸轉運體(glatamate aspartate transporter,GLAST)和谷氨酸轉運體-1(glutamate transporter-1,GLT-1)等蛋白表達的降低,而這些轉運體或蛋白都是星形膠質細胞重攝取細胞外谷氨酸并合成谷氨酰胺的關鍵性蛋白。有研究顯示錳(manganese,Mn)攝入過量可以對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成毒性損傷,能影響星形膠質細胞GS的活性以及GLAST和GLT-1的表達。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)鉛、錳在單獨暴露下能夠誘導MG活化,結合鉛、錳暴露對星形膠質細胞活性及其谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)的影響,我們推測在鉛、錳聯(lián)合暴露中小膠質細胞活化可能會調控星形膠質細胞功能進而影響神經(jīng)元功能,從而最終誘導認知功能的損傷。研究目的:本實驗以SD大鼠、BV2細胞、C6細胞、原代小膠質細胞及星形膠質細胞為研究對象,探討低劑量鉛錳聯(lián)合暴露對不同類型膠質細胞活化順序的影響以及對神經(jīng)元膠質細胞間谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)的影響,闡明小膠質細胞誘導星形膠質細胞功能改變在鉛錳聯(lián)合暴露致認知功能損傷中的作用及機制,為低劑量鉛錳聯(lián)合暴露致學習記憶功能損傷提供新的理論依據(jù)。研究方法:1.飲水染毒建立鉛錳聯(lián)合暴露動物模型;建系細胞和原代細胞建立體外共培養(yǎng)模型。2.原子吸收分光光度法檢測SD大鼠血鉛和血錳含量;膜片鉗技術檢測LTP;通過水迷宮實驗檢測大鼠逃避潛伏期時間和目的象限停留時間百分比評價大鼠的學習記憶能力。MTT篩選建系細胞體外染毒劑量;免疫熒光法和Western blot篩選原代細胞體外染毒劑量。3.免疫熒光法和Western blot檢測膠質細胞的活化和谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)相關蛋白的表達。研究結果:1.鉛錳聯(lián)合暴露動物模型的建立在100ppm Pb、2.5g/L Mn、5g/L Mn、Pb+2.5g/L Mn和Pb+5g/L Mn的暴露劑量下,通過原子吸收法檢測血鉛和血錳含量、膜片鉗技術檢測LTP的誘導水平和水迷宮實驗篩選出鉛的染毒劑量為100ppm,錳的劑量為2.5g/L。2.鉛錳聯(lián)合暴露對認知功能損傷的協(xié)同效應1)染毒3w后,各暴露組LTP誘導水平與對照組相比均顯著降低(p0.05),并在聯(lián)合暴露組出現(xiàn)協(xié)同損傷效應。2)水迷宮檢測結果顯示,各暴露組大鼠逃避潛伏期時間和目的象限停留時間百分比與對照組相比差異顯著,聯(lián)合暴露時差異更為顯著(p0.05)。3.鉛錳聯(lián)合暴露對不同類型膠質細胞活化的時間效應及活化后的影響1)免疫熒光法和Western blot法檢測SD大鼠海馬部位小膠質細胞和星形膠質細胞的形態(tài)及各自特異性活化maker的表達水平。結果顯示,暴露3d后,與對照組相比,鉛錳聯(lián)合暴露組小膠質細胞出現(xiàn)顯著活化,OX-42表達水平明顯升高(p0.05);而星形膠質細胞形態(tài)未發(fā)生改變。5d后,各暴露組小膠質細胞均呈現(xiàn)活化狀態(tài)并在聯(lián)合暴露時更顯著,此時星形膠質細胞在聯(lián)合暴露組也出現(xiàn)了顯著活化,GFAP表達水平顯著升高(p0.05)。Western blot法檢測海馬星形膠質細胞谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)相關蛋白的表達水平,結果顯示,暴露2w后,GS、GLT-1和GLAST的表達水平明顯降低,且在聯(lián)合暴露時降低更為顯著(p0.05)。2)篩選合適的鉛錳聯(lián)合暴露體外染毒劑量10μmol/L醋酸鉛和100μmol/L氯化錳,時間為24h。建系細胞與原代細胞在直接刺激時GFAP、GS、GLT-1和GLAST蛋白表達水平與對照組相比均沒有明顯改變。共培養(yǎng)后,鉛錳聯(lián)合暴露可以引起GS、GLT-1和GLAST表達降低(p0.05)。4.米諾環(huán)素干預對鉛錳聯(lián)合暴露毒性損傷的拮抗作用1)用米諾環(huán)素(Minocycline)拮抗小膠質細胞活化后,與各暴露組相比,米諾環(huán)素干預組大鼠空間學習記憶功能的損傷得到一定程度的緩解(p0.05)。2)免疫熒光法檢測暴露2w后海馬部位膠質細胞的形態(tài),發(fā)現(xiàn)各暴露組小膠質細胞及星形膠質細胞均出現(xiàn)顯著活化,聯(lián)合暴露活化更為明顯;在米諾環(huán)素干預下各暴露組小膠質細胞活化和星形膠質細胞活化均得到顯著抑制(p0.05)。Western blot結果顯示,各暴露組GS、GLT-1和GLAST表達水平出現(xiàn)降低,在聯(lián)合暴露時出現(xiàn)協(xié)同降低,米諾環(huán)素干預后各暴露組谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)相關蛋白表達水平的降低得到顯著回升(p0.05)。研究結論:1.低劑量鉛錳聯(lián)合暴露可以產(chǎn)生協(xié)同神經(jīng)毒性,導致學習記憶功能受損;2.膠質細胞活化參與了鉛錳聯(lián)合暴露所誘導神經(jīng)毒性進程。在鉛錳聯(lián)合暴露條件下,小膠質細胞首先被激活,繼而星形膠質細胞出現(xiàn)活化進而導致星形膠質細胞與神經(jīng)元間的谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)遭到破壞,使神經(jīng)元功能受到損傷,證實了星形膠質細胞在學習記憶功能中的重要作用;3.以米諾環(huán)素拮抗小膠質細胞活化后,星形膠質細胞活性及其谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán)的損傷得到顯著緩解,學習記憶功能的損傷也得到顯著恢復,揭示了小膠質細胞活化在星形膠質細胞的功能改變中發(fā)揮著重要作用。
【關鍵詞】：鉛 錳 小膠質細胞 星形膠質細胞 谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán) 學習記憶
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R114
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-15
• 文獻回顧15-26
• 實驗一 鉛錳聯(lián)合暴露動物模型的建立26-33
• 1 材料26-27
• 2 方法27-29
• 3 結果29-31
• 4 討論31-33
• 實驗二 鉛錳聯(lián)合暴露對認知功能損傷的協(xié)同效應33-38
• 1 材料33-34
• 2 方法34-35
• 3 結果35-37
• 4 討論37-38
• 實驗三 鉛錳聯(lián)合暴露對不同類型膠質細胞活化的時間效應及活化后的影響38-61
• 1 材料38-41
• 2 方法41-46
• 3 結果46-58
• 4 討論58-61
• 實驗四 米諾環(huán)素干預對鉛錳聯(lián)合暴露毒性損傷的拮抗作用61-69
• 1 材料61-63
• 2 方法63-64
• 3 結果64-67
• 4 討論67-69
• 小結69-70
• 參考文獻70-82
• 個人簡歷和研究成果82-83
• 致謝83

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