本文關(guān)鍵詞：TCE致L-02肝細(xì)胞毒性中SET相關(guān)的表現(xiàn)遺傳調(diào)控機(jī)制的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：三氯乙烯(Trich Loroethy Lene,TCE)是一種工業(yè)上廣泛使用的有機(jī)溶劑,同時(shí)也是一種重要的環(huán)境污染物。其可通過(guò)多種途徑進(jìn)入人體,肝臟作為其主要的代謝場(chǎng)所,三氯乙烯代謝物蓄積于肝臟,導(dǎo)致肝毒性發(fā)生或引發(fā)肝損傷,嚴(yán)重者甚至發(fā)生肝衰竭或死亡。對(duì)TCE致肝細(xì)胞毒性的作用機(jī)制了解尚淺。SET基因在肝細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá),其自身作為一種原癌基因,參與了生物體內(nèi)多種重要的生理過(guò)程:例如細(xì)胞凋亡,轉(zhuǎn)錄過(guò)程,染色體復(fù)制等。課題組前期研究篩選出SET差異表達(dá)蛋白,初步研究了SET相關(guān)的表觀遺傳調(diào)控因子對(duì)TCE致肝細(xì)胞毒性效應(yīng)的影響,檢測(cè)了TCE作用下肝細(xì)胞中基因組整體甲基化變化情況。但SET相關(guān)的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制是如何解釋TCE誘導(dǎo)肝細(xì)胞毒性效應(yīng)這一問(wèn)題尚待研究,本論文將進(jìn)一步研究SET基因啟動(dòng)子甲基化變化對(duì)TCE致肝細(xì)胞毒性效應(yīng)的作用機(jī)制,及初步探索SET相關(guān)的mi RNA調(diào)控能否解釋TCE致肝細(xì)胞毒性效應(yīng)的發(fā)生機(jī)理。方法和結(jié)果 本課題從以下兩方面開(kāi)展研究:研究1:TCE作用下肝細(xì)胞中SET基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)分析方法:培養(yǎng)L-02肝細(xì)胞,使用不同濃度的TCE(0 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、4 mmol/L、8 mmol/L)處理L-02細(xì)胞24 h,提取細(xì)胞基因組DNA,用亞硫酸氫鹽試劑盒進(jìn)行修飾,設(shè)計(jì)引物后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分子克隆和測(cè)序。結(jié)果及結(jié)論:與對(duì)照組相比,TCE處理的L-02肝細(xì)胞中SET基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平下降,且隨著TCE染毒濃度的增加,SET基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平遞減。對(duì)甲基化差異位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),p0.05的差異甲基化位點(diǎn)有73個(gè),這些位點(diǎn)中已知序列名稱的有24個(gè);位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)的差異甲基化位點(diǎn)有9個(gè),這些位點(diǎn)上均有多個(gè)已知的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。差異甲基化位點(diǎn)的出現(xiàn)限制了轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合,造成染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性改變,導(dǎo)致SET基因表達(dá)異常,驗(yàn)證了SET蛋白是TCE作用下肝細(xì)胞中的表達(dá)升高的差異蛋白(結(jié)合課題組前期研究基礎(chǔ))。研究2:TCE作用下肝細(xì)胞中SET相關(guān)的mi RNA調(diào)控的初步研究方法:通過(guò)mi RNA靶基因預(yù)測(cè)軟件和文獻(xiàn)查找方法初步篩選出SET相關(guān)的多個(gè)mi RNAs,然后使用RT-PCR檢測(cè)這些mi RNAs的表達(dá)情況,以表達(dá)下調(diào)的mi RNAs作為研究對(duì)象。構(gòu)建這些mi RNAs的病毒載體,獲取相應(yīng)病毒上清后轉(zhuǎn)染L-02肝細(xì)胞,構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)mi RNAs肝細(xì)胞并對(duì)其高表達(dá)效率進(jìn)行鑒定。結(jié)果及結(jié)論:利用多種預(yù)測(cè)軟件和文獻(xiàn)查找初篩了9個(gè)候選mi RNAs,即mi RNA-23a,mi RNA-21,mi RNA-199b,mi RNA-20a,mi RNA-29b,mi RNA-199a,mi RNA-194,mi RNA-221和mi RNA-129。但表達(dá)下調(diào)的mi RNAs為mi RNA-23a,mi RNA-21,mi RNA-199b,mi RNA-20a。成功構(gòu)建了其中三個(gè)mi RNAs重組病毒載體,轉(zhuǎn)染L-02肝細(xì)胞后,這些mi RNAs在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的RT-PCR分析顯示,與轉(zhuǎn)染空病毒載體的對(duì)照組相比,mi R-199b/21/23a等的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的1300、3、5倍以上,說(shuō)明穩(wěn)定高表達(dá)mi R-199b/21/23a肝細(xì)胞構(gòu)建成功。
【關(guān)鍵詞】：L-02肝細(xì)胞 SET蛋白 DNA甲基化 miRNA調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R114
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 前言12-21
• 1.1 三氯乙烯簡(jiǎn)介12-13
• 1.1.1 三氯乙烯的生物毒性12-13
• 1.2 SET蛋白綜述13-14
• 1.3 表觀遺傳調(diào)控14-18
• 1.3.1 DNA甲基化15-16
• 1.3.2 mi RNA調(diào)控16-18
• 1.4 課題研究基礎(chǔ)、目的意義及實(shí)驗(yàn)方案18-20
• 1.4.1 課題研究基礎(chǔ)18
• 1.4.2 課題研究的目的意義18-19
• 1.4.3 課題研究方案19-20
• 1.5 課題研究的創(chuàng)新點(diǎn)20-21
• 第2章 材料與方法21-51
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-24
• 2.1.1 主要儀器設(shè)備21-22
• 2.1.2 主要試劑22-23
• 2.1.3 細(xì)胞及細(xì)胞受試物23-24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-51
• 2.2.1 培養(yǎng)基和常用試劑的配制24-25
• 2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和染毒25
• 2.2.3 細(xì)胞DNA提取25-26
• 2.2.4 DNA的亞硫酸氫鹽修飾26-30
• 2.2.5 PCR擴(kuò)增30-32
• 2.2.6 基因克隆和測(cè)序32-34
• 2.2.7 統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)分析34
• 2.2.8 獲得與SET基因關(guān)聯(lián)的目的mi RNA34-37
• 2.2.9 獲得mi RNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄本Pri-mi RNA基因產(chǎn)物37-42
• 2.2.10 p CI Mamma Lian Expression Vector質(zhì)粒載體的雙酶切及回收42-43
• 2.2.11 p CI Mamma Lian Expression Vector質(zhì)粒載體與Pri-mi RNA基因產(chǎn)物的連接43
• 2.2.12 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化43
• 2.2.13 Pri-mi RNA重組質(zhì)粒載體的鑒定、擴(kuò)增及提取43-45
• 2.2.14 獲得含綠色熒光基因的Pri-mi RNA基因序列45-47
• 2.2.15 雙酶切p CDH-CMV-MCS-EF1-Puro病毒載體47-48
• 2.2.16 雙酶切后的p CDH-CMV-MCS-EF1-Puro病毒載體與Zsgreen+Pri-mi R-21/23A/20A/199B產(chǎn)物的連接48
• 2.2.17 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化48-49
• 2.2.18 Pri-mi RNA重組病毒載體的鑒定、擴(kuò)增及提取49
• 2.2.19 轉(zhuǎn)染Pri-mi RNA重組病毒載體進(jìn)行病毒包裝49
• 2.2.20 病毒滴度檢測(cè)與濃縮49-50
• 2.2.21 病毒上清轉(zhuǎn)染L-02肝細(xì)胞50
• 2.2.22 mi RNA重組病毒載體在肝細(xì)胞中的表達(dá)鑒定50-51
• 第3章 結(jié)果與分析51-80
• 3.1 TCE作用下肝細(xì)胞中SET基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)分析51-70
• 3.1.1 DNA完整性檢測(cè)51
• 3.1.2 SET基因五段啟動(dòng)片段的甲基化位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果51-66
• 3.1.3 SET基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平分析66
• 3.1.4 SET基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化位點(diǎn)分析66-69
• 3.1.5 SET基因啟動(dòng)子區(qū)差異甲基化及其結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子分析69-70
• 3.2 TCE作用下肝細(xì)胞中SET相關(guān)的mi RNA調(diào)控的初步研究70-80
• 3.2.1 候選mi RNAs的相對(duì)定量檢測(cè)分析70-74
• 3.2.2 Pri-mi RNA質(zhì)粒載體的鑒定74-76
• 3.2.3 Pri-mi RNA重組病毒載體的鑒定76-78
• 3.2.4 Pri-mi RNA重組病毒載體的病毒上清轉(zhuǎn)染L-02肝細(xì)胞及其表達(dá)鑒定78-80
• 第4章 討論與結(jié)論80-86
• 4.1 TCE作用下肝細(xì)胞中SET基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平檢測(cè)分析80-82
• 4.1.1 SET基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平檢測(cè)分析80-82
• 4.2 TCE作用下肝細(xì)胞中SET相關(guān)的mi RNAs調(diào)控的初步研究82-86
• 4.2.1 生物信息學(xué)篩選mi RNAs82-83
• 4.2.2 SET相關(guān)的mi RNA調(diào)控及mi RNA治療展望83-86
• 4.3 結(jié)論86
• 課題展望86-87
• 參考文獻(xiàn)87-96
• 附錄：英文縮略詞表96-97
• 綜述97-109
• 參考文獻(xiàn)103-109
• 致謝109-110
• 攻讀碩士學(xué)位期間取得的成果110-112

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 彭巨成;劉益民;余日安;吳禮康;吳泰順;朱志良;;三氯乙烯對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡及c-myc和p53基因表達(dá)的影響[J];毒理學(xué)雜志;2010年04期

2 劉建軍;黃海燕;趙錦;莊志雄;袁建輝;陽(yáng)帆;何建凡;李習(xí)藝;;三氯乙烯誘導(dǎo)人L-02肝細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析[J];中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志;2006年04期

3 彭巨成;劉益民;余日安;吳禮康;吳泰順;朱志良;;三氯乙烯對(duì)大鼠肝細(xì)胞DNA損傷和氧化應(yīng)激的影響[J];職業(yè)與健康;2009年24期

  本文關(guān)鍵詞：TCE致L-02肝細(xì)胞毒性中SET相關(guān)的表現(xiàn)遺傳調(diào)控機(jī)制的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：467532