本文關(guān)鍵詞：電離輻射對(duì)小鼠小腸絨毛上皮細(xì)胞和固有層纖維細(xì)胞作用的基因表達(dá)譜研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景:早前在研究C60(OH)24-SLN-E的對(duì)小鼠輻射防護(hù)作用研究時(shí),發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)6 Gy 60Co?射線照后21天的小鼠小腸固有層細(xì)胞中的γ-H2AX foci數(shù)量遠(yuǎn)多于小腸絨毛上皮細(xì)胞,這一現(xiàn)象提示兩種細(xì)胞在DNA修復(fù)能力上存在差異。目的:探索小腸絨毛上皮細(xì)胞和固有層細(xì)胞在DNA損傷修復(fù)能力產(chǎn)生差異的分子機(jī)制,尋找治療腸型放射病的關(guān)鍵靶分子。方法:(1)小鼠小腸絨毛上皮細(xì)胞和固有層纖維細(xì)胞在體外進(jìn)行原代培養(yǎng)和傳代。再將每種細(xì)胞各分為兩組,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)過(guò)6Gy X線照射并修復(fù)6小時(shí);對(duì)照組不照射。(2)細(xì)胞照射后6小時(shí),用western blot檢測(cè)分析γ-H2AX的蛋白表達(dá)水平。(3)細(xì)胞照射后6小時(shí),提取每個(gè)樣品的總RNA,合成標(biāo)記探針c DNA并與基因芯片進(jìn)行雜交,通過(guò)芯片掃描獲得基因表達(dá)數(shù)據(jù)并進(jìn)行差異基因篩選,進(jìn)一步對(duì)差異基因進(jìn)行GO分析和PATHWAY分析。結(jié)果:(1)成功培養(yǎng)并獲得原代小腸絨毛上皮細(xì)胞和固有層纖維細(xì)胞。(2)X射線照射并修復(fù)6小時(shí)后,小鼠小腸絨毛上皮細(xì)胞和固有層纖維細(xì)胞的γ-H2AX蛋白表達(dá)量都上升,但兩者之間沒(méi)有顯著的差別。(3)在參與DSB非同源末端連接和同源重組修復(fù)的基因表達(dá)中,兩種細(xì)胞有9個(gè)基因存在表達(dá)差異,包括POLM、XRCC5、FEN1、XRCC2、POLD3、POLD2、EME1、RAD54B和BRCA2基因,且在小腸絨毛上皮細(xì)胞的表達(dá)都顯著高于固有層纖維細(xì)胞。照射后6小時(shí),固有層纖維細(xì)胞中RAD54B表達(dá)明顯下調(diào);除上述9個(gè)基因存在差異表達(dá)外,RAD51和RPA2也有差異表達(dá),同樣在小腸絨毛上皮細(xì)胞的表達(dá)都顯著高于固有層纖維細(xì)胞。除此之外,受照后的兩種細(xì)胞中,參與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控的部分基因也有表達(dá)差異。結(jié)論:本課題成功獲得了原代培養(yǎng)的小鼠小腸絨毛上皮細(xì)胞和固有層纖維細(xì)胞并用于基因表達(dá)差異的研究。研究發(fā)現(xiàn),由于參與DNA非同源末端連接和同源重組修復(fù)相關(guān)蛋白明顯高表達(dá),受照小鼠小腸絨毛上皮細(xì)胞DNA雙鏈斷裂修復(fù)能力明顯強(qiáng)于固有層纖維細(xì)胞,其中RAD54B基因的下調(diào)表達(dá)可能在受照小腸固有層纖維細(xì)胞DNA雙鏈斷裂修復(fù)延遲方面發(fā)揮重要作用。
【關(guān)鍵詞】：小腸絨毛上皮細(xì)胞 小腸固有層纖維細(xì)胞 原代培養(yǎng) DNA損傷修復(fù) 基因芯片
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R818
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-14
• 第一部分 小鼠小腸絨毛上皮細(xì)胞和固有層纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)14-20
• 一、實(shí)驗(yàn)材料14-15
• 1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象14
• 2.主要試劑14-15
• 3.主要儀器和設(shè)備15
• 二、實(shí)驗(yàn)方法15-16
• 1.原代培養(yǎng)皿的準(zhǔn)備15
• 2.上皮細(xì)胞的前處理15
• 3.組織塊培養(yǎng)法15-16
• 4.酶消化分離法16
• 5.原代細(xì)胞傳代16
• 6.原代細(xì)胞復(fù)蘇16
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果16-18
• 四、討論18-19
• 五、小結(jié)19-20
• 第二部分 小鼠小腸絨毛上皮細(xì)胞和固有層纖維細(xì)胞的 Γ-H2AX蛋白分析20-26
• 一、實(shí)驗(yàn)材料20-21
• 1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象20
• 2.主要試劑20-21
• 3.主要儀器和設(shè)備21
• 二、實(shí)驗(yàn)方法21-23
• 1.原代細(xì)胞的處理21
• 2.蛋白樣制備21-22
• 3. BCA法測(cè)蛋白濃度22
• 4.蛋白變性22
• 5.制 15%的SDS-PAGE膠22
• 6.加樣和垂直電泳22
• 7.轉(zhuǎn)膜22-23
• 8.封閉與抗體孵育23
• 9.上機(jī)23
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果23
• 四、討論23-25
• 五、小結(jié)25-26
• 第三部分 小鼠小腸絨毛上皮細(xì)胞和固有層纖維細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究26-54
• 一、實(shí)驗(yàn)材料26-28
• 1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象26
• 2.主要試劑26-27
• 3.主要儀器和設(shè)備27-28
• 二、實(shí)驗(yàn)方法28-31
• 1.提取TOTAL RNA28
• 2.總RNA的純化28-29
• 3.CDNA第一鏈和第二鏈一步法合成29
• 4.熒光標(biāo)記CRNA合成29
• 5.CRNA純化29-30
• 6.CRNA濃度測(cè)定30
• 7.熒光分子濃度及摻入率計(jì)算30
• 8.CRNA樣品片段化和芯片雜交30-31
• 9.芯片洗滌31
• 10.芯片掃描31
• 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-47
• 1.RNA樣品質(zhì)檢基本信息31-33
• 2.基因芯片檢測(cè)結(jié)果33-47
• 四、討論47-52
• 五、小結(jié)52-54
• 全文總結(jié)54-55
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 綜述59-69
• 參考文獻(xiàn)66-69
• 中英文縮略詞對(duì)照表69-70
• 致謝70-72

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本文編號(hào)：449076