本文關(guān)鍵詞：鎘暴露致小鼠卵巢顆粒細(xì)胞激素合成障礙中Sf-1基因的表達(dá)及其DNA的甲基化，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:通過體外培養(yǎng)26日齡小鼠卵巢顆粒細(xì)胞,觀察不同濃度、不同時間鎘暴露后顆粒細(xì)胞形態(tài)及激素分泌功能的改變,探討鎘暴露致未成年小鼠卵巢顆粒細(xì)胞激素合成障礙中Sf-1基因的表達(dá)及其DNA的甲基化情況,為進(jìn)一步研究鎘暴露對卵巢細(xì)胞功能的影響及其機制提供新思路。方法:提取26日齡雌性ICR小鼠卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁,形態(tài)穩(wěn)定后,將細(xì)胞隨機分為四組,分別加入含終濃度為0、10、20、40μM的氯化鎘的細(xì)胞培養(yǎng)液,待染毒結(jié)束后處理。分別于染毒2 h、4 h、6 h、8 h后進(jìn)行:1、倒置顯微鏡下觀察顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化;2、ELISA法檢測顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中E2及P4濃度;3、實時熒光定量PCR法檢測Sf-1基因m RNA表達(dá)變化情況;4、Western blotting法檢測SF-1蛋白表達(dá)變化情況;5、于染毒6 h后,提取顆粒細(xì)胞DNA,結(jié)合堿基特異性酶切反應(yīng)與MALDI-TOF-MS檢測原理,運用Sequenom公司的Mass ARRAY檢測系統(tǒng),檢測Sf-1基因啟動子區(qū)DNA甲基化情況。結(jié)果:1.鎘對卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響:隨著鎘染毒劑量的增加和時間的延長,卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變,染毒組與對照組比較,細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞突觸收起,細(xì)胞變圓,折光性變強,高劑量組可見部分漂浮的死細(xì)胞,且隨著染毒時間的延長,死細(xì)胞增多。2.(1)鎘對卵巢顆粒細(xì)胞E2分泌水平的影響:①同一染毒時間下,隨著染毒劑量的增加,顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中雌激素水平存在下降趨勢(趨勢性檢驗P0.01)。其中分別染毒2 h和4 h后,20μM、40μM組細(xì)胞培養(yǎng)液中的E2水平低于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);染毒6 h和8 h后,10μM、20μM、40μM組細(xì)胞培養(yǎng)液中的E2水平明顯低于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。②同一染毒劑量下,隨著染毒時間的增加,顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中雌激素水平存在升高的趨勢(趨勢性檢驗P0.05).其中,在10μM劑量下,染毒4 h后培養(yǎng)液中E2水平與染毒2 h后的水平相比明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);Control組、20μM、40μM染毒劑量下,培養(yǎng)4 h、8 h后,培養(yǎng)液中E2水平與培養(yǎng)2 h后的水平相比明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(2)鎘對卵巢顆粒細(xì)胞P4分泌水平的影響:①同一染毒時間不同染毒劑量的變化:染毒2 h后,10μM、20μM組培養(yǎng)液中的P4水平高于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);染毒4 h后,隨著染毒劑量的增加,顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中P4水平存在下降趨勢(趨勢性檢驗P0.05),其中20μM、40μM組培養(yǎng)液中的P4水平明顯低于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);分別染毒6 h和8 h后各劑量組培養(yǎng)液中的P4水平與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。②同一染毒劑量不同染毒時間的變化:Control組、10μM、40μM染毒劑量下,隨著培養(yǎng)時間的增加,培養(yǎng)液中P4水平存在升高趨勢(趨勢性檢驗P0.05)。其中,0μM組經(jīng)8h培養(yǎng)后,培養(yǎng)液中P4水平與染毒2 h后的比較明顯升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);在10μM劑量下,染毒4 h、6 h、8 h后培養(yǎng)液中P4水平與染毒2 h后的比較明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);在20μM劑量下,染毒4 h后培養(yǎng)液中P4水平與染毒2 h后的比較明顯降低(P0.05)。3.鎘對卵巢顆粒細(xì)胞Sf-1基因的m RNA表達(dá)的影響:(1)同一染毒時間不同染毒劑量變化:分別染毒2 h后,各染毒組顆粒細(xì)胞Sf-1基因m RNA表達(dá)水平與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);分別染毒4 h、6 h、8 h后,各染毒組Sf-1基因m RNA表達(dá)水平均低于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且4 h、6 h、8 h實驗組Sf-1基因的m RNA表達(dá)水平隨著染毒劑量的增加存在著下降的趨勢(趨勢性檢驗P0.01)。(2)同一染毒劑量不同染毒時間變化:在10μM、20μM、40μM染毒劑量下,Sf-1基因m RNA表達(dá)水平隨著染毒時間的延長而下降(趨勢性檢驗P0.05)。其中,10μM劑量下染毒8 h后,Sf-1基因m RNA表達(dá)水平與染毒2 h后的水平相比明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);20μM劑量下染毒6 h后,Sf-1基因m RNA表達(dá)水平與染毒2 h后的水平相比明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);40μM劑量下分別染毒6 h、8 h后,Sf-1基因m RNA表達(dá)水平與染毒2 h后的水平相比明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.鎘對卵巢顆粒細(xì)胞SF-1蛋白表達(dá)的影響:(1)同一染毒時間不同染毒劑量變化:分別染毒2 h后,各染毒組顆粒細(xì)胞SF-1蛋白的表達(dá)水平與對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);分別染毒4 h后,20μM、40μM組SF-1蛋白表達(dá)水平均低于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);分別染毒6 h、8 h后,各染毒組SF-1蛋白表達(dá)水平均低于對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且4 h、6 h、8 h實驗組SF-1蛋白表達(dá)水平隨著染毒劑量的增加存在著下降的趨勢(趨勢性檢驗P0.01)。(2)同一染毒劑量不同染毒時間變化:在10μM、20μM、40μM染毒劑量下,SF-1蛋白表達(dá)水平隨著染毒時間的延長而下降(趨勢性檢驗P0.01)。其中,10μM劑量下染毒6 h、8 h后,SF-1蛋白表達(dá)水平與染毒2 h后的水平相比明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);在20μM、40μM劑量下,染毒4 h、6 h、8 h后,SF-1蛋白表達(dá)水平與染毒2 h后的水平相比明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5、鎘對卵巢顆粒細(xì)胞Sf-1基因DNA甲基化的影響:用Sequenom DNA甲基化檢測平臺實際檢測到的CG位點為9個,但是由于第7、8、9位點有些劑量組CG位點的甲基化率為0,所以最終納入分析的為1-6位點,數(shù)據(jù)經(jīng)整理分析結(jié)果顯示Sf-1基因各組總體甲基化率均呈現(xiàn)較低甲基化,且與溶劑對照組比較,DAC處理組及各Cd Cl2染毒組Sf-1基因DNA啟動子區(qū)CG位點甲基化率無明顯改變,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、在本次實驗條件下,鎘對小鼠卵巢顆粒細(xì)胞存在一定的毒性作用,表現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的改變,及一定劑量范圍內(nèi)抑制卵巢顆粒細(xì)胞分泌雌二醇和孕酮。2、體外鎘(10-40μM)暴露后,Sf-1基因m RNA和蛋白表達(dá)下調(diào),可能是鎘致激素分泌及合成障礙的重要機制之一。3、鎘暴露卵巢顆粒細(xì)胞后Sf-1基因啟動子區(qū)DNA呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài),鎘可能不是通過Sf-1基因啟動子區(qū)DNA甲基化來調(diào)控Sf-1的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：鎘 卵巢顆粒細(xì)胞 激素 Sf-1基因表達(dá) DNA甲基化
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R114
【目錄】：

• 英文縮寫詞匯表3-4
• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 前言11-15
• 技術(shù)路線15-16
• 一、材料與方法16-31
• 1 材料16-19
• 2 方法19-31
• 二、結(jié)果31-47
• 1 鎘對小鼠卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響31-34
• 2 鎘對小鼠卵巢顆粒細(xì)胞激素分泌的影響34-38
• 3.鎘對卵巢顆粒細(xì)胞 Sf-1 的 m RNA 及蛋白表達(dá)的影響38-43
• 4 鎘暴露對小鼠卵巢顆粒細(xì)胞 Sf-1 基因 DNA 甲基化的影響43-47
• 三、討論47-51
• 1.鎘暴露致小鼠卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)及雌、孕激素分泌功能的影響47-48
• 2.鎘暴露對小鼠卵巢顆粒細(xì)胞 Sf-1 表達(dá)的影響48-49
• 3.鎘暴露對小鼠卵巢顆粒細(xì)胞 Sf-1 基因 DNA 啟動子區(qū)甲基化的影響49-51
• 四、結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-58
• 致謝58-59
• 綜述59-65
• 參考文獻(xiàn)63-65

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本文編號：444472