本文關(guān)鍵詞：基于mRNA的RT-PCR技術(shù)快速檢測(cè)水消毒效果的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 建立一種基于mRNA的大腸桿菌RT-PCR檢測(cè)方法,檢測(cè)消毒前后水中大腸桿菌的存活情況,為快速評(píng)價(jià)飲用水消毒效果提供方法。 方法 1.選取三種大腸桿菌特異基因——tuf A基因、β-半乳糖苷酶基因和β-葡萄糖醛酸酶基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)合成,選用大腸桿菌8099菌種,十倍梯度系列稀釋后,提取mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR,不斷優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,經(jīng)40輪基因擴(kuò)增后,使用2%瓊脂糖凝膠電泳觀察檢測(cè)結(jié)果。 2.參照《消毒技術(shù)規(guī)范》(2002版)中懸液定量殺菌試驗(yàn)的內(nèi)容,采用常用水消毒劑——二氯異氰尿酸鈉和二氧化氯進(jìn)行消毒試驗(yàn),使用傳統(tǒng)培養(yǎng)法、普通PCR技術(shù)和RT-PCR方法檢測(cè)消毒前后大腸桿菌活菌、DNA和RNA的存在情況,并分別進(jìn)行對(duì)比分析。 3.消毒試驗(yàn)中試驗(yàn)菌懸液采用兩種常用水消毒劑低濃度劑量消毒處理后,作用管在4℃環(huán)境中放置12h,于5個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR試驗(yàn),觀察目的mRNA信號(hào)檢出隨時(shí)間變化的情況,定性判斷新方法用于水消毒效果評(píng)價(jià)的時(shí)效性。 結(jié)果 1.使用大腸桿菌β-葡萄糖醛酸酶基因設(shè)計(jì)合成引物,建立基于mRNA的反轉(zhuǎn)錄PCR方法用于大腸桿菌活菌的快速檢測(cè),檢測(cè)時(shí)間約為6-8h,特異性強(qiáng),檢測(cè)靈敏度約為3.6×103cfu/mL。 2.大腸桿菌菌懸液經(jīng)40mg/L二氯異氰尿酸鈉溶液處理5min后,培養(yǎng)法顯示細(xì)菌被完全殺滅；普通PCR方法細(xì)菌DNA檢測(cè)結(jié)果強(qiáng)陽性；RT-PCR方法細(xì)菌RNA檢測(cè)結(jié)果陰性。經(jīng)20mg/L二氯異氰尿酸鈉溶液處理5min后,培養(yǎng)法顯示剩余菌液濃度為4.0×103cfu/mL;普通PCR方法細(xì)菌DNA檢測(cè)結(jié)果強(qiáng)陽性,即有高濃度大腸桿菌DNA存在；RT-PCR方法顯示弱陽性,即菌液濃度較低。 3.大腸桿菌菌懸液經(jīng)4mg/L二氧化氯溶液處理5min后,培養(yǎng)法顯示細(xì)菌被完全殺滅；普通PCR方法細(xì)菌DNA檢測(cè)結(jié)果強(qiáng)陽性；RT-PCR方法細(xì)菌RNA檢測(cè)結(jié)果陰性。經(jīng)0.8mg/L二氧化氯溶液處理5min后,培養(yǎng)法顯示剩余菌液濃度為8.9×103cfu/mL;普通PCR方法顯示強(qiáng)陽性,即有高濃度大腸桿菌DNA存在；RT-PCR方法顯示弱陽性,即菌液濃度較低。 4.經(jīng)20mg/L二氯異氰尿酸鈉溶液、0.8mg/L二氧化氯溶液處理的大腸桿菌菌懸液,置于4℃環(huán)境中,12h內(nèi),培養(yǎng)法檢測(cè)大腸桿菌菌液濃度未發(fā)生明顯改變,RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示弱陽性,且條帶亮度基本保持不變。 結(jié)論 1.在實(shí)驗(yàn)室條件下,新建立的反轉(zhuǎn)錄PCR方法可以快速、特異的檢出大腸桿菌活菌,最低檢出限為3.6×103cfu/mL。 2.在實(shí)驗(yàn)室條件下,進(jìn)行二氯異氰尿酸鈉和二氧化氯水消毒效果鑒定評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)室階段,當(dāng)大腸桿菌活菌數(shù)在新方法最低檢出限之上時(shí),新建立的RT-PCR方法可以定性的檢測(cè)消毒效果,與培養(yǎng)法一致。 3.4℃條件下,在低濃度二氯異氰尿酸鈉或二氧化氯作用后的環(huán)境中,大腸桿菌死菌mRNA分子迅速降解；RT-PCR方法對(duì)于兩種消毒劑消毒后活菌的檢測(cè)是準(zhǔn)確的,可以去除死菌的干擾。
【關(guān)鍵詞】：反轉(zhuǎn)錄PCR 消毒 假陽性 活菌檢測(cè)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R123.6;R440
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-11
• 前言11-20
• 1.1 引言11-12
• 1.2 水消毒處理的常用方法及消毒效果評(píng)價(jià)方法12-13
• 1.3 細(xì)菌檢測(cè)方法的研究進(jìn)展13-16
• 1.4 活菌檢測(cè)技術(shù)16-19
• 1.5 小結(jié)19-20
• 第一部分 基于mRNA-RT-PCR快速檢測(cè)大腸桿菌方法的建立20-38
• 2.1 引言20
• 2.2 材料與儀器20-22
• 2.3 技術(shù)路線22-23
• 2.4 試驗(yàn)方法23-28
• 2.5 試驗(yàn)結(jié)果28-33
• 2.6 討論33-35
• 2.7 實(shí)驗(yàn)操作關(guān)鍵點(diǎn)及注意事項(xiàng)35-37
• 2.8 小結(jié)37-38
• 第二部分 基于mRNA-RT-PCR方法的水消毒效果評(píng)價(jià)38-53
• 3.1 引言38
• 3.2 材料與儀器38-40
• 3.3 技術(shù)路線40-41
• 3.4 試驗(yàn)方法及結(jié)果41-49
• 3.5 討論49-51
• 3.6 實(shí)驗(yàn)操作關(guān)鍵點(diǎn)及注意事項(xiàng)51-52
• 3.7 小結(jié)52-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 發(fā)表文章57-66
• 參考文獻(xiàn)63-66
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷66-67
• 致謝67

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：基于mRNA的RT-PCR技術(shù)快速檢測(cè)水消毒效果的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：378014