本文關(guān)鍵詞：基于mRNA的RT-PCR技術(shù)快速檢測水消毒效果的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 建立一種基于mRNA的大腸桿菌RT-PCR檢測方法,檢測消毒前后水中大腸桿菌的存活情況,為快速評價飲用水消毒效果提供方法。 方法 1.選取三種大腸桿菌特異基因——tuf A基因、β-半乳糖苷酶基因和β-葡萄糖醛酸酶基因進行引物設(shè)計合成,選用大腸桿菌8099菌種,十倍梯度系列稀釋后,提取mRNA進行反轉(zhuǎn)錄PCR,不斷優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,經(jīng)40輪基因擴增后,使用2%瓊脂糖凝膠電泳觀察檢測結(jié)果。 2.參照《消毒技術(shù)規(guī)范》(2002版)中懸液定量殺菌試驗的內(nèi)容,采用常用水消毒劑——二氯異氰尿酸鈉和二氧化氯進行消毒試驗,使用傳統(tǒng)培養(yǎng)法、普通PCR技術(shù)和RT-PCR方法檢測消毒前后大腸桿菌活菌、DNA和RNA的存在情況,并分別進行對比分析。 3.消毒試驗中試驗菌懸液采用兩種常用水消毒劑低濃度劑量消毒處理后,作用管在4℃環(huán)境中放置12h,于5個不同時間點進行反轉(zhuǎn)錄PCR試驗,觀察目的mRNA信號檢出隨時間變化的情況,定性判斷新方法用于水消毒效果評價的時效性。 結(jié)果 1.使用大腸桿菌β-葡萄糖醛酸酶基因設(shè)計合成引物,建立基于mRNA的反轉(zhuǎn)錄PCR方法用于大腸桿菌活菌的快速檢測,檢測時間約為6-8h,特異性強,檢測靈敏度約為3.6×103cfu/mL。 2.大腸桿菌菌懸液經(jīng)40mg/L二氯異氰尿酸鈉溶液處理5min后,培養(yǎng)法顯示細(xì)菌被完全殺滅；普通PCR方法細(xì)菌DNA檢測結(jié)果強陽性；RT-PCR方法細(xì)菌RNA檢測結(jié)果陰性。經(jīng)20mg/L二氯異氰尿酸鈉溶液處理5min后,培養(yǎng)法顯示剩余菌液濃度為4.0×103cfu/mL;普通PCR方法細(xì)菌DNA檢測結(jié)果強陽性,即有高濃度大腸桿菌DNA存在；RT-PCR方法顯示弱陽性,即菌液濃度較低。 3.大腸桿菌菌懸液經(jīng)4mg/L二氧化氯溶液處理5min后,培養(yǎng)法顯示細(xì)菌被完全殺滅；普通PCR方法細(xì)菌DNA檢測結(jié)果強陽性；RT-PCR方法細(xì)菌RNA檢測結(jié)果陰性。經(jīng)0.8mg/L二氧化氯溶液處理5min后,培養(yǎng)法顯示剩余菌液濃度為8.9×103cfu/mL;普通PCR方法顯示強陽性,即有高濃度大腸桿菌DNA存在；RT-PCR方法顯示弱陽性,即菌液濃度較低。 4.經(jīng)20mg/L二氯異氰尿酸鈉溶液、0.8mg/L二氧化氯溶液處理的大腸桿菌菌懸液,置于4℃環(huán)境中,12h內(nèi),培養(yǎng)法檢測大腸桿菌菌液濃度未發(fā)生明顯改變,RT-PCR方法檢測結(jié)果顯示弱陽性,且條帶亮度基本保持不變。 結(jié)論 1.在實驗室條件下,新建立的反轉(zhuǎn)錄PCR方法可以快速、特異的檢出大腸桿菌活菌,最低檢出限為3.6×103cfu/mL。 2.在實驗室條件下,進行二氯異氰尿酸鈉和二氧化氯水消毒效果鑒定評價的實驗室階段,當(dāng)大腸桿菌活菌數(shù)在新方法最低檢出限之上時,新建立的RT-PCR方法可以定性的檢測消毒效果,與培養(yǎng)法一致。 3.4℃條件下,在低濃度二氯異氰尿酸鈉或二氧化氯作用后的環(huán)境中,大腸桿菌死菌mRNA分子迅速降解；RT-PCR方法對于兩種消毒劑消毒后活菌的檢測是準(zhǔn)確的,可以去除死菌的干擾。
【關(guān)鍵詞】：反轉(zhuǎn)錄PCR 消毒 假陽性 活菌檢測
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R123.6;R440
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-11
• 前言11-20
• 1.1 引言11-12
• 1.2 水消毒處理的常用方法及消毒效果評價方法12-13
• 1.3 細(xì)菌檢測方法的研究進展13-16
• 1.4 活菌檢測技術(shù)16-19
• 1.5 小結(jié)19-20
• 第一部分 基于mRNA-RT-PCR快速檢測大腸桿菌方法的建立20-38
• 2.1 引言20
• 2.2 材料與儀器20-22
• 2.3 技術(shù)路線22-23
• 2.4 試驗方法23-28
• 2.5 試驗結(jié)果28-33
• 2.6 討論33-35
• 2.7 實驗操作關(guān)鍵點及注意事項35-37
• 2.8 小結(jié)37-38
• 第二部分 基于mRNA-RT-PCR方法的水消毒效果評價38-53
• 3.1 引言38
• 3.2 材料與儀器38-40
• 3.3 技術(shù)路線40-41
• 3.4 試驗方法及結(jié)果41-49
• 3.5 討論49-51
• 3.6 實驗操作關(guān)鍵點及注意事項51-52
• 3.7 小結(jié)52-53
• 參考文獻53-57
• 發(fā)表文章57-66
• 參考文獻63-66
• 個人簡歷66-67
• 致謝67

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：基于mRNA的RT-PCR技術(shù)快速檢測水消毒效果的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：378014