本文關(guān)鍵詞：基于過表達(dá)研究氟對TGF-β信號通路的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]通過研究TGF-β1過表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染氟暴露下的小鼠睪丸支持細(xì)胞,旨在研究氟暴露對小鼠睪丸支持細(xì)胞免疫豁免功能的影響機理,對研究氟對生殖系統(tǒng)的毒理作用有重要的意義,從而對氟中毒治療提供理論依據(jù)。[方法]本實驗通過設(shè)置不同濃度梯度的氟化鈉溶液模擬小鼠體內(nèi)氟對睪丸支持細(xì)胞免疫豁免功能的影響。通過雙酶切、瓊脂糖凝膠回收等方法構(gòu)建TGF-β1過表達(dá)模型;通過瞬時轉(zhuǎn)染將重組載體導(dǎo)入事先在體外培養(yǎng)小鼠睪丸支持細(xì)胞中；應(yīng)用Real-time-PCR技術(shù)研究氟對smad2、smad3、smad4、smad6、smad7等基因的mRNA表達(dá)的影響；利用酶聯(lián)免疫吸附測定試驗(ELISA)技術(shù)檢測細(xì)胞上清液中IL-6和TNF-α的表達(dá)水平變化,從而說明氟暴露對睪丸支持細(xì)胞免疫豁免功能的影響。[結(jié)果](1)電泳及測序結(jié)果表明：過表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-TGF-β1構(gòu)建成功。(2) Real time-PCR和Western Blotting結(jié)果表明：過表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-TGF-β1成功轉(zhuǎn)染小鼠睪丸支持細(xì)胞。(3) Real time-PCR結(jié)果表明：與對照組相比,實驗組的smad2、smad4 mRNA表達(dá)水平均未有明顯差異;但相比對照組和10~(-3)mM、10-5mM NaF組,10~(-4)mM NaF對smad3基因影響差異顯著;相比對照組和10-5mM NaF組.10~(-3)mM、10~(-4)mM NaF對smad6基因影響差異極其顯著;相比對照組而言,10~(-3)mM、10~(-4)mM 10-5mM NaF對smad7基因影響差異均極其顯著。(4)酶聯(lián)免疫吸附測定試驗(ELISA)結(jié)果說明：在TGF-β1過表達(dá)及不同濃度的氟暴露雙因子作用下,相比對照組,實驗組IL-1β、IL-6及TNF-α因子表達(dá)水平均在最大氟濃度處有明顯提高且差異顯著;其中,IL-1β和TNF-α因子均在10~(-3)mM NaF處濃度變化差異明顯,而IL-6因子在10~(-3)mM、10~(-4)mM NaF處濃度變化均有較大差異。[結(jié)論]氟是通過影響TGF-β1表達(dá)水平的變化,而對小鼠睪丸支持細(xì)胞免疫豁免功能產(chǎn)生破壞作用,從而對機體產(chǎn)生生殖毒性。
【關(guān)鍵詞】：TGF-β1 氟暴露 睪丸支持細(xì)胞 免疫豁免
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R114
【目錄】：

• 摘要6-7
• 前言7-8
• 1 文獻(xiàn)綜述8-14
• 1.1 TGF-β信號通路研究進展8-12
• 1.1.1 TGF-β信號通路結(jié)構(gòu)組成8-10
• 1.1.2 TGF-β信號通路重要的生理功能10-12
• 1.2 免疫豁免研究進展12-13
• 1.3 小鼠睪丸支持細(xì)胞研究進展13-14
• 1.3.1 睪丸支持細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)13-14
• 2 材料與方法14-29
• 2.1 實驗材料14-18
• 2.1.1 主要試劑14-17
• 2.1.2 主要儀器17-18
• 2.2 實驗方法18-29
• 2.2.1 構(gòu)建真核表達(dá)載體18-21
• 2.2.2 支持細(xì)胞分離與培養(yǎng)21-22
• 2.2.3 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染支持細(xì)胞的鑒定實驗22-27
• 2.2.4 氟化鈉對TGF-β信號通路的影響實驗27-29
• 3 實驗結(jié)果29-37
• 3.1 構(gòu)建真核表達(dá)載體29-31
• 3.1.1 小鼠pcDNA3.1-TGF-β1重組載體的構(gòu)建29
• 3.1.2 重組載體測序結(jié)果29-31
• 3.2 支持細(xì)胞的分離與培養(yǎng)31-32
• 3.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察31
• 3.2.2 支持細(xì)胞姬姆薩染色結(jié)果31-32
• 3.2.3 GATA4免疫熒光和免疫組化染色結(jié)果32
• 3.3 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染支持細(xì)胞的鑒定32-34
• 3.3.1 qRT-PCR檢測支持細(xì)胞中TGF-β1過表達(dá)情況32-34
• 3.3.2 蛋白水平的檢測TGF-β_1的表達(dá)情況34
• 3.4 氟化鈉對TGF-β信號通路的影響34-37
• 3.4.2 熒光定量PCR檢測目的基因mRNA表達(dá)結(jié)果35-36
• 3.4.3 相關(guān)免疫因子含量變化情況36-37
• 4 分析與討論37-41
• 4.1 構(gòu)建真核表達(dá)載體37
• 4.1.1 酶切位點的正確選擇37
• 4.1.2 目的片段中引入Kozak序列的目的37
• 4.2 支持細(xì)胞分離與培養(yǎng)37-39
• 4.2.1 小鼠睪丸支持細(xì)胞的體外培養(yǎng)與細(xì)胞傳代38
• 4.2.2 小鼠支持細(xì)胞的生物學(xué)鑒定方法38-39
• 4.3 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染支持細(xì)胞的鑒定39
• 4.4 氟化鈉對TGF-β信號通路的影響實驗39-41
• 4.4.1 檢測IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β_1的原因39-40
• 4.4.2 Smad7蛋白表達(dá)下調(diào)的解釋40-41
• 5 結(jié)論41-42
• 5.1 構(gòu)建真核表達(dá)載體41
• 5.2 支持細(xì)胞的分離與培養(yǎng)41
• 5.3 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染支持細(xì)胞的鑒定41
• 5.4 氟化鈉對TGF-β信號通路的影響實驗41-42
• 全文結(jié)論42-44
• 參考文獻(xiàn)44-48
• Abstract48-50
• 致謝50

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