發(fā)布時間：2017-04-26 03:05

  本文關(guān)鍵詞：重組Lac Z酵母細(xì)胞構(gòu)建及對化學(xué)誘變原的高通量篩選研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：基因毒性(Genotoxic)是指能直接或間接損傷細(xì)胞DNA的性質(zhì)。誘變原即具有基因毒性作用的化合物,它能夠改變機體細(xì)胞遺傳物質(zhì)而誘發(fā)突變。當(dāng)今,化學(xué)誘變原已成為危害環(huán)境和人類健康的一大類因素,防止這類化學(xué)污染物對環(huán)境污染成為人類預(yù)防癌癥的重要手段之一。目前,人們已經(jīng)提出多種對致突變化學(xué)誘變原毒性評價的試驗方法,如Ames試驗、微核和染色體試驗等。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,一些常規(guī)的評價檢測方法的缺點逐漸突顯出來：敏感度低,耗時較長,操作繁瑣以及成本過高等方面成為了影響對化學(xué)誘變原毒性評價的因素。本課題利用生物傳感器技術(shù),與其中的微生物傳感器技術(shù)相結(jié)合,用重組的酵母細(xì)胞作為宿主細(xì)胞,用Lac Z作用為報告基因,利用經(jīng)化學(xué)誘變原作用后表達(dá)產(chǎn)物可催化底物顯色這一特性,特性作為信號轉(zhuǎn)換的標(biāo)識,評價致突變化學(xué)物的毒性作用強度。化學(xué)誘變物主要分為兩類：直接化學(xué)誘變物和間接化學(xué)誘變物,前者對DNA具有直接損傷作用,后者自身對DNA無損傷作用,但其進入機體內(nèi)可經(jīng)某些反應(yīng)轉(zhuǎn)化為具有基因毒性作用的物質(zhì)。本課題利用構(gòu)建重組酵母細(xì)胞分別對直接和間接化學(xué)誘變物進行高通量篩選研究。1.重組酵母細(xì)胞W303-1A/RNR3-LacZ的構(gòu)建及對直接誘變物的篩選目的：建立由RNR3調(diào)控重組Lac Z基因酵母細(xì)胞以篩選直接化學(xué)誘變物。方法：利用PCR方法從酵母基因組中擴增RNR3啟動子,將其插入到pMP206/ERE酵母報告載體,構(gòu)建成RNR3調(diào)控的Lac Z酵母報告載體,將該載體轉(zhuǎn)入W303-1A酵母細(xì)胞,構(gòu)建成RNR3調(diào)控的重組Lac Z基因酵母細(xì)胞。用數(shù)種化學(xué)誘變原作用于該重組基因酵母細(xì)胞,觀察其對RNR3的誘導(dǎo)表達(dá),用Excel軟件進行分析。結(jié)果：放線菌素D、絲裂霉素C、阿非迪霉素和溴乙錠不能誘導(dǎo)RNR3的表達(dá),而甲磺酸甲脂、瘤可寧、順鉑、4-硝基-N-氧化喹啉、博來霉素、福來霉素、5-氟尿嘧啶、喜樹堿和羥基脲誘變原與RNR3表達(dá)有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)論：該重組酵母可用于對多種化學(xué)誘變原的快速篩選。2.重組酵母細(xì)胞W303-1A/RNR3-LacZ/GPDV5-CYP1A1的構(gòu)建及對間接誘變物的篩選目的：建立由RNR3調(diào)控重組Lac Z基因及可表達(dá)CYP1A1基因的重組酵母細(xì)胞以篩選間接化學(xué)誘變物。方法：利用PCR方法從GV142質(zhì)粒上擴增CYP1A1基因,將其插入到pGPDV5酵母表達(dá)載體上,構(gòu)建成PGPDV5-CYP1A1酵母表達(dá)載體,將該載體轉(zhuǎn)入所建立的W303-1A/RNR3-Lac Z重組酵母細(xì)胞,構(gòu)建成可表達(dá)CYP1A1及受RNR3調(diào)控的Lac Z基因酵母細(xì)胞。用Promega公司的試劑盒檢測CYP1A1表達(dá),并用間接誘變原2-氨基芴作用于該重組基因酵母細(xì)胞,觀察其對RNR3的誘導(dǎo)表達(dá),用Excel軟件進行分析。結(jié)果：DNA測序表明pGPDV5-CYP1A1酵母表達(dá)載體構(gòu)建成功,并經(jīng)PCR鑒定已經(jīng)成功重組于酵母細(xì)胞,但經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)CYP1A1活性較低,細(xì)胞經(jīng)2-氨基芴作用后,與Lac Z表達(dá)無明顯時間劑量效應(yīng)。結(jié)論：CYP1A1表達(dá)量不足,可能在轉(zhuǎn)錄或翻譯過程中受到某些因素的阻斷,導(dǎo)致該重組酵母細(xì)胞不能很好的篩選間接誘變原,其原因還有待進一步研究。
【關(guān)鍵詞】：化學(xué)誘變原 酵母 β-半乳糖苷酶 Lac Z基因 CYP1A1
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R114
【目錄】：

• 摘要2-4
• 英文摘要4-8
• 第一章 文獻綜述8-16
• 參考文獻14-16
• 符號說明16-17
• 第二章 直接誘變原的篩選17-38
• 1. 材料與方法17-29
• 2. 結(jié)果29-38
• 第三章 間接誘變原的篩選38-56
• 1. 材料與方法38-49
• 2. 結(jié)果49-56
• 討論56-60
• 參考文獻60-63
• 致謝63-64
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄64-65

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  本文關(guān)鍵詞：重組Lac Z酵母細(xì)胞構(gòu)建及對化學(xué)誘變原的高通量篩選研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：327585