發(fā)布時(shí)間：2017-04-17 05:18

  本文關(guān)鍵詞：丙烯酰胺誘導(dǎo)HT22小鼠海馬神經(jīng)元損傷作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)是一種高水溶性的α,β-不飽和羰基化合物,主要用來合成聚丙烯酰胺,聚丙烯酰胺在采礦業(yè)、污水凈化、造紙業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。聚丙烯酰胺無毒,但丙烯酰胺單體是有毒的。自2002年科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)富含淀粉的食物在經(jīng)受高溫油炸或烘烤時(shí)能生成丙烯酰胺后,其危害日益引起人們的重視。動物實(shí)驗(yàn)證實(shí),丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性、致癌性、遺傳毒性、生殖毒性,但在人群中卻只發(fā)現(xiàn)了它的神經(jīng)毒性。丙烯酰胺神經(jīng)毒性的臨床表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)、骨骼肌無力,體重減輕;病理表現(xiàn)為中樞和周圍神經(jīng)軸突的遠(yuǎn)端腫脹和終末變性,并逐漸向近端擴(kuò)展。丙烯酰胺引起神經(jīng)毒性的可能機(jī)制主要有抑制快速軸突運(yùn)輸、改變神經(jīng)遞質(zhì)水平和功能、抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、影響細(xì)胞骨架系統(tǒng)、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的能量代謝等。此外,氧化應(yīng)激和促進(jìn)細(xì)胞凋亡也可能是丙烯酰胺潛在的神經(jīng)毒性機(jī)制。我們實(shí)驗(yàn)室前期工作已證實(shí):丙烯酰胺亞急性染毒能夠引起幼年大鼠神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷,大腦皮質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元和小腦皮質(zhì)內(nèi)浦肯野細(xì)胞發(fā)生變性損傷;胚胎期和哺乳期暴露于丙烯酰胺能導(dǎo)致幼鼠出生時(shí)體重降低,哺乳期間體重增長緩慢,并影響到海馬神經(jīng)元的發(fā)育。海馬主要參與學(xué)習(xí)、記憶、情緒反應(yīng)等多種功能活動,其損傷能對學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生影響,有研究證實(shí)丙烯酰胺能夠損傷海馬,但損傷的具體機(jī)制目前尚不明確。為此,我們開展了丙烯酰胺的體外毒性研究。HT22細(xì)胞是一種永生化的小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞,具有典型的神經(jīng)元形態(tài)及特征,其表型與神經(jīng)元前體細(xì)胞最為相似,被廣泛應(yīng)用于研究藥物的神經(jīng)毒性、神經(jīng)元的損傷和保護(hù)之中。但用HT22細(xì)胞來建立丙烯酰胺體外損傷模型的相關(guān)研究少見報(bào)道,故本研究以HT22細(xì)胞為細(xì)胞模型,研究丙烯酰胺對海馬神經(jīng)元的損傷作用,并對其損傷的可能機(jī)制進(jìn)行探討。方法:1.丙烯酰胺對HT22細(xì)胞存活率的影響及模型濃度的篩選:當(dāng)HT22細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí),加入不同濃度的丙烯酰胺,處理24h、36h和48h,MTT法檢測細(xì)胞的增殖狀態(tài),并選擇合適的濃度進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。2.丙烯酰胺對HT22細(xì)胞損傷的影響研究:當(dāng)HT22細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí),加入不同濃度的丙烯酰胺處理24h后,倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的形態(tài)變化;Hoechst33258染色來觀察各組細(xì)胞核的變化;應(yīng)用試劑盒檢測乳酸脫氫酶(LDH)的漏出量。3.丙烯酰胺對HT22細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響研究:用DCFH-DA熒光探針來檢測活性氧ROS的含量;黃嘌呤氧化法檢測超氧化物歧化酶(SOD)的活力;硫代巴比妥酸(TBA)法檢測丙二醛(MDA)的含量;二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)法檢測還原型谷胱甘肽(GSH)的含量。4.丙烯酰胺對HT22細(xì)胞凋亡的影響研究:羅丹明123(Rh123)染色檢測線粒體膜電位(MMP)的變化;Western blot法檢測Bax、Bcl-2、Cleaved caspase3蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1.不同濃度的丙烯酰胺(0、1、2、3、4、8、16mmol/L)處理HT22細(xì)胞24h、36h和48h后,細(xì)胞存活率隨著濃度的增加和時(shí)間的延長而降低,說明丙烯酰胺對HT22細(xì)胞存活率的影響呈時(shí)間和劑量依賴性。2.我們選用0、1、2、3mmol/L的丙烯酰胺濃度處理HT22細(xì)胞24h來作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的損傷濃度。倒置顯微鏡下觀察到隨著濃度的升高,細(xì)胞胞體逐漸變圓,突起變短,折光率下降;用Hoechst33258染料染色,對照組細(xì)胞核均勻淡染,邊緣清晰;而染毒組的細(xì)胞核有深染固縮、形狀不規(guī)則、裂解的核出現(xiàn),與對照組相比異常核的數(shù)量也有增加;且隨著ACR濃度的增加,培養(yǎng)上清中LDH的含量也顯著增加(P0.05 vs對照組)。3.丙烯酰胺處理HT22細(xì)胞24h后,細(xì)胞內(nèi)ROS的積聚增加,MDA的含量升高,SOD的活性下降,GSH的含量下降。4.丙烯酰胺處理HT22細(xì)胞24h后,細(xì)胞線粒體膜電位下降;Bax和Cleaved caspase3蛋白的表達(dá)水平上調(diào),Bcl-2蛋白的表達(dá)水平下調(diào)。結(jié)論:1.丙烯酰胺可以抑制HT22細(xì)胞的增殖,且對其影響呈時(shí)間和劑量依賴性。2.丙烯酰胺染毒能導(dǎo)致HT22細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞核凋亡、細(xì)胞膜損傷。3.丙烯酰胺的神經(jīng)毒性機(jī)制,可能是通過增加細(xì)胞內(nèi)ROS的積聚和MDA的含量,降低SOD的活性和GSH的含量,產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷來實(shí)現(xiàn)的。4.丙烯酰胺的神經(jīng)毒性機(jī)制,還可能與降低線粒體膜電位,上調(diào)Bax和Cleaved caspase3蛋白的表達(dá),下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá),進(jìn)而誘發(fā)HT22細(xì)胞的凋亡有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：丙烯酰胺 HT22 氧化應(yīng)激 凋亡
【學(xué)位授予單位】：廣東藥學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R114
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 序言13-17
• 材料與方法17-27
• 1 實(shí)驗(yàn)材料17-21
• 1.1 主要試劑17-18
• 1.2 主要儀器18-19
• 1.3 實(shí)驗(yàn)常用耗材19
• 1.4 常用培養(yǎng)溶液的配制19-21
• 2 實(shí)驗(yàn)方法21-27
• 2.1 細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、凍存及計(jì)數(shù)21-22
• 2.2 MTT法檢測HT22 細(xì)胞的存活率22-23
• 2.3 HT22 細(xì)胞形態(tài)變化觀察23
• 2.4 Hoechst33258 染色23
• 2.5 HT22 細(xì)胞中乳酸脫氫酶（LDH）漏出量的檢測23
• 2.6 HT22 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的檢測23-24
• 2.7 HT22 細(xì)胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性的檢測24
• 2.8 HT22 細(xì)胞內(nèi)丙二醛（MDA）含量的檢測24
• 2.9 HT22 細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）含量的檢測24-25
• 2.10 HT22 細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位（MMP）的檢測25
• 2.11 Western blot法檢測HT22 細(xì)胞中的凋亡相關(guān)蛋白25-26
• 2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析26-27
• 結(jié)果27-38
• 1 不同濃度ACR對HT22 細(xì)胞存活率的影響27
• 2 不同濃度ACR對HT22 細(xì)胞形態(tài)的影響27-28
• 3 不同濃度ACR對HT22 細(xì)胞核形態(tài)的影響28-29
• 4 不同濃度ACR對HT22 細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDH）漏出量的影響29-30
• 5 不同濃度ACR對HT22 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的影響30-31
• 6 不同濃度ACR對HT22 細(xì)胞中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）的影響31-34
• 7 不同濃度ACR對HT22 細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位（MMP）的影響34-35
• 8 Western blot法檢測HT22 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白35-38
• 8.1 不同濃度ACR對HT22 細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)的影響35-36
• 8.2 不同濃度ACR對HT22 細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響36
• 8.3 不同濃度ACR對HT22 細(xì)胞中Cleaved caspase3 蛋白表達(dá)的影響36-38
• 討論38-44
• 1. ACR對HT22 細(xì)胞具有毒性損傷作用38-39
• 2. ACR對HT22 細(xì)胞的損傷可能與氧化應(yīng)激有關(guān)39-41
• 3.ACR對HT22 細(xì)胞的損傷還可能與促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)41-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-51
• 中英文縮略詞表51-52
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文52-53
• 致謝53

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前6條

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6 李凱凱;謝炅芳;王久濤;宋玲珍;張偉;陳樹林;趙善廷;;丙烯酰胺對小鼠成體神經(jīng)發(fā)生及GSK3β表達(dá)的影響[J];中國免疫學(xué)雜志;2015年02期

  本文關(guān)鍵詞：丙烯酰胺誘導(dǎo)HT22小鼠海馬神經(jīng)元損傷作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：312508