重金屬鉛、鎘、砷和汞廣泛存在于人類賴以生存的環(huán)境和食品中,同時(shí)它們也是世界衛(wèi)生組織公布的公共衛(wèi)生領(lǐng)域所關(guān)注的十大主要化學(xué)物中僅有的四種重金屬,且是一般人群血液中能檢測(cè)到的典型神經(jīng)毒物。暴露于其中的某一單個(gè)重金屬對(duì)人體的危害已被廣泛研究,且發(fā)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)學(xué)習(xí)和記憶的損傷作用較為明顯。然而,人類暴露環(huán)境化學(xué)物質(zhì)最明顯的特點(diǎn)是暴露于其混合物中。截至目前,聯(lián)合暴露于鉛、鎘、砷和汞這四種重金屬對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響尚未見報(bào)道。研究證實(shí),神經(jīng)元通過突觸連接活動(dòng)的強(qiáng)度和頻率的改變來處理和保留信息,神經(jīng)元的突觸重構(gòu)與神經(jīng)系統(tǒng)功能如學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)。突觸高度動(dòng)態(tài)重構(gòu)性的關(guān)鍵在于突觸處特定結(jié)構(gòu)樹突棘的重排。此外,植物多酚類化合物是廣泛存在于植物體內(nèi)的一種具有多個(gè)酚羥基的次生代謝產(chǎn)物,具有抗氧化、抗腫瘤、抗毒性以及神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)等作用。常見的植物多酚類化合物葡萄多酚白藜蘆醇和茶多酚表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)均具有很好的神經(jīng)保護(hù)特性,并對(duì)突觸重構(gòu)損傷具有一定的調(diào)節(jié)改善作用。故本課題旨在探討鉛、鎘、砷和汞四種重金屬低劑量聯(lián)合暴露對(duì)神經(jīng)突觸重構(gòu)損傷以及植物多酚類化合物的調(diào)節(jié)干預(yù)作用。本課題首先在體外培養(yǎng)的不同神經(jīng)細(xì)胞上采用正交和析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)探索鉛、鎘、砷和汞四種重金屬在其混合物中的交互作用特點(diǎn),并篩選出重金屬混合物低水平的作用劑量和模式。然后,通過整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證低劑量鉛、鎘、砷和汞聯(lián)合暴露對(duì)仔鼠多系統(tǒng)毒性損傷,尤其是神經(jīng)系統(tǒng)損傷,并進(jìn)一步研究其對(duì)神經(jīng)突觸重構(gòu)的影響及其機(jī)制。最后,通過給予植物多酚類化合物白藜蘆醇和EGCG探討其對(duì)鉛、鎘、砷和汞四種重金屬所致神經(jīng)突觸重構(gòu)損傷的干預(yù)作用�，F(xiàn)將本論文主要研究結(jié)果歸納如下:1.四金屬聯(lián)合暴露劑量和模式的選擇。CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力,并結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)探索鉛、鎘、砷和汞四種重金屬在其混合物(metal mixtures,MM)中的細(xì)胞毒性交互作用的特點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)單個(gè)重金屬暴露濃度低于未觀察到有害作用水平(no observed adverse effect levels,NOAELs)時(shí),四金屬聯(lián)合暴露可產(chǎn)生協(xié)同作用引起細(xì)胞毒性損傷,且當(dāng)單個(gè)重金屬劑量與一般人群血液負(fù)荷水平比例相似時(shí),其聯(lián)合作用效果最強(qiáng)。故選擇一般人群血液中該四種重金屬水平(1×MM)以及其5倍(5×MM)和10倍(10×MM)的水平進(jìn)行析因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)后檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞活力、凋亡、活性氧以及胞內(nèi)游離鈣水平等細(xì)胞損傷指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),低劑量四金屬聯(lián)合暴露產(chǎn)生新的不同于兩種或三種重金屬的聯(lián)合作用毒性效應(yīng)。2.四金屬聯(lián)合暴露對(duì)整體動(dòng)物各系統(tǒng)損傷。孕鼠通過飲水暴露濃度梯度鉛、鎘、砷和汞四金屬混合物(對(duì)照組、1×MM、5×MM、10×MM和20×MM)直至仔鼠斷乳。仔鼠經(jīng)過胚胎和哺乳等發(fā)育敏感期暴露四金屬后進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。ICP-MS檢測(cè)血液和腦組織鉛、鎘、砷和汞含量;HE染色檢測(cè)各臟器病理?yè)p傷;ELISA試劑盒檢測(cè)各臟器生化指標(biāo)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,1×MM暴露組仔鼠血液中鉛、鎘、砷和汞含量與一般人群四金屬暴露濃度接近。此外,仔鼠血液和腦組織中鉛、鎘、砷、汞含量均隨著四金屬聯(lián)合暴露濃度的增加而呈現(xiàn)劑量反應(yīng)增加。因此本實(shí)驗(yàn)四金屬聯(lián)合暴露動(dòng)物模型建立成功。四金屬聯(lián)合暴露仔鼠包括大腦、肝臟、睪丸和腎臟在內(nèi)的多個(gè)臟器病理?yè)p傷和生化分子水平損傷均隨著暴露劑量增加而加重,且以神經(jīng)系統(tǒng)損傷尤為明顯。3.四金屬聯(lián)合暴露對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能及突觸重構(gòu)損傷。通過一系列行為功能試驗(yàn)檢測(cè)仔鼠學(xué)習(xí)記憶、感知覺以及運(yùn)動(dòng)能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),仔鼠學(xué)習(xí)記憶和感知覺能力損傷隨著四金屬聯(lián)合暴露劑量增加而加重。而仔鼠運(yùn)動(dòng)能力對(duì)四金屬聯(lián)合暴露后不敏感。需要強(qiáng)調(diào)的是,懸崖回避試驗(yàn)檢測(cè)的仔鼠空間感知覺能力在1×MM組,即一般人群四金屬暴露水平暴露后便出現(xiàn)差異。在大鼠神經(jīng)行為功能發(fā)現(xiàn)損傷的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞上使用鬼筆環(huán)肽F-actin染色分析細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),四金屬聯(lián)合暴露降低了原代海馬神經(jīng)元樹突的長(zhǎng)度和分支以及樹突棘的密度和成熟表型,并縮短了NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞生長(zhǎng)的神經(jīng)突起長(zhǎng)度。4.四金屬聯(lián)合暴露對(duì)突觸重構(gòu)相關(guān)通路Snk-SPAR損傷。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞血清誘導(dǎo)激酶(serum-induced kinase,Snk)和樹突棘相關(guān)的Rap三磷酸鳥苷酶激活蛋白(Spine-associated Rap GTPase-activating protein,SPAR)蛋白表達(dá)量;構(gòu)建干擾質(zhì)粒sh RNA Snk、野生型質(zhì)粒Wt-SPAR、突變型質(zhì)粒Mut-SPAR,并進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。結(jié)果發(fā)現(xiàn),海馬神經(jīng)元和NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞SPAR表達(dá)在四金屬聯(lián)合暴露后出現(xiàn)濃度依賴性地降低。SPAR過表達(dá)減緩四金屬聯(lián)合暴露所致NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)突起生長(zhǎng)的變化,Mut-SPAR轉(zhuǎn)染比Wt-SPAR轉(zhuǎn)染表現(xiàn)出更好地改善效果。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),海馬神經(jīng)元和NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Snk的表達(dá)也隨四金屬聯(lián)合暴露濃度增加而上調(diào)。Snk激動(dòng)劑加重四金屬所致NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)突起和Snk-SPAR通路的變化。Snk低表達(dá)改善四金屬聯(lián)合暴露所致的NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)突起和Snk-SPAR通路的變化。5.白藜蘆醇和EGCG對(duì)四金屬聯(lián)合暴露后突觸重構(gòu)損害的干預(yù)作用。CCK8檢測(cè)細(xì)胞活力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡、活性氧和胞內(nèi)游離鈣水平;鬼筆環(huán)肽F-actin染色分析細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu);細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞Snk和SPAR蛋白表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),10μM白藜蘆醇和10μM EGCG分別處理后,均逆轉(zhuǎn)了四金屬聯(lián)合暴露所致的細(xì)胞毒性損傷。此外,四金屬聯(lián)合暴露通過激活Snk-SPAR通路而導(dǎo)致的突觸重構(gòu)損傷在白藜蘆醇和EGCG干預(yù)后也出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明,在一般人群暴露的相關(guān)水平,且單個(gè)重金屬暴露濃度低于NOAELs時(shí),鉛、鎘、砷和汞聯(lián)合暴露可能通過激活Snk-SPAR通路引起突觸重構(gòu)損傷進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)行為障礙。而植物多酚類化合物白藜蘆醇和EGCG可以逆轉(zhuǎn)鉛、鎘、砷和汞聯(lián)合暴露所致突觸重構(gòu)損傷,它們可以作為預(yù)防和治療重金屬聯(lián)合暴露所致以突觸重構(gòu)損傷為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂相關(guān)疾病的潛在干預(yù)藥物。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R114
【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略詞表
第1章 引言
    1.1 重金屬的神經(jīng)毒性作用研究進(jìn)展
        1.1.1 鉛的神經(jīng)毒性作用
        1.1.2 鎘的神經(jīng)毒性作用
        1.1.3 砷的神經(jīng)毒性作用
        1.1.4 汞的神經(jīng)毒性作用
    1.2 植物多酚類化合物的神經(jīng)保護(hù)作用研究進(jìn)展
        1.2.1 白藜蘆醇的神經(jīng)保護(hù)作用
        1.2.2 表沒食子兒茶素沒食子酸酯的神經(jīng)保護(hù)作用
    1.3 本課題的研究目的、意義和主要內(nèi)容
        1.3.1 課題來源
        1.3.2 本課題立題背景及意義
        1.3.3 主要研究?jī)?nèi)容
第2章 四金屬聯(lián)合暴露劑量和模式的選擇
    2.1 概述
    2.2 材料和方法
        2.2.1 材料
        2.2.2 方法
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 鉛、鎘、砷和汞對(duì)不同類型神經(jīng)細(xì)胞活力的單獨(dú)作用
        2.3.2 鉛、鎘、砷和汞聯(lián)合暴露交互作用規(guī)律探索
2+]i的影響'>        2.3.3 四金屬聯(lián)合暴露對(duì)細(xì)胞分子水平凋亡、ROS和 [Ca²⁺]i的影響
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第3章 四金屬聯(lián)合暴露對(duì)整體動(dòng)物各系統(tǒng)損傷
    3.1 概述
    3.2 材料和方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 方法
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 四金屬聯(lián)合暴露對(duì)仔鼠基本情況影響
        3.3.2 四金屬聯(lián)合暴露對(duì)仔鼠血元素影響
        3.3.3 四金屬聯(lián)合暴露對(duì)仔鼠各系統(tǒng)臟器系數(shù)影響
        3.3.4 四金屬聯(lián)合暴露對(duì)仔鼠各臟器病理影響
        3.3.5 四金屬聯(lián)合暴露對(duì)仔鼠各臟器生化及分子水平影響
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第4章 四金屬聯(lián)合暴露對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能及突觸重構(gòu)損害
    4.1 概述
    4.2 材料和方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 方法
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 四金屬聯(lián)合暴露對(duì)仔鼠行為功能損傷
        4.3.2 四金屬聯(lián)合暴露對(duì)原代海馬神經(jīng)元樹突結(jié)構(gòu)影響
        4.3.3 四金屬聯(lián)合暴露對(duì)NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞突起結(jié)構(gòu)影響
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第5章 四金屬聯(lián)合暴露對(duì)突觸重構(gòu)相關(guān)通路SNK-SPAR影響
    5.1 概述
    5.2 材料和方法
        5.2.1 材料
        5.2.2 方法
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 四金屬聯(lián)合暴露下調(diào)海馬神經(jīng)元和NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞SPAR表達(dá)
        5.3.2 SPAR過表達(dá)減緩四金屬導(dǎo)致的NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)突起生長(zhǎng)的變化
        5.3.3 四金屬暴露上調(diào)海馬神經(jīng)元和NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞Snk的表達(dá)
        5.3.4 Snk激動(dòng)劑加重四金屬導(dǎo)致的NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)突起和Snk-SPAR通路的變化
        5.3.5 Snk低表達(dá)減緩四金屬導(dǎo)致的NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞神經(jīng)突起和Snk-SPAR通路的變化
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
第6章 植物多酚類化合物對(duì)四金屬聯(lián)合暴露后突觸重構(gòu)損害的干預(yù)作用
    6.1 概述
    6.2 材料和方法
        6.2.1 材料
        6.2.2 方法
    6.3 結(jié)果
        6.3.1 白藜蘆醇和EGCG干預(yù)作用劑量的選擇
2+]i的干預(yù)作用'>        6.3.2 白藜蘆醇和EGCG對(duì)四金屬聯(lián)合暴露后細(xì)胞活力、凋亡、ROS和[Ca²⁺]i的干預(yù)作用
        6.3.3 白藜蘆醇和EGCG對(duì)四金屬聯(lián)合暴露后神經(jīng)突起結(jié)構(gòu)損傷的干預(yù)作用
        6.3.4 白藜蘆醇和EGCG對(duì)四金屬聯(lián)合暴露后Snk-SPAR通路改變的干預(yù)作用
    6.4 討論
    6.5 小結(jié)
第7章 結(jié)論
    7.1 概述
    7.2 主要結(jié)論
    7.3 本課題創(chuàng)新之處
    7.4 進(jìn)一步的工作方向
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間的研究成果

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本文編號(hào)：2884706