本文關(guān)鍵詞：沉默Keap1基因?qū)rf2相關(guān)基因表達(dá)的影響及在砷皮膚氧化應(yīng)激損傷中作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:研究Keap1基因沉默對(duì)Nrf2相關(guān)基因表達(dá)在砷致皮膚細(xì)胞毒性中的作用,為砷致皮膚損傷提供理論依據(jù)。方法:1.慢病毒載體的構(gòu)建。依據(jù)Keap1基因序列構(gòu)建Keap1sh RNA,采用BamH I,EcoR I雙酶切載體,T4ligase連接載體與目的基因,經(jīng)感受肽細(xì)胞轉(zhuǎn)化后,平板挑菌培養(yǎng),菌液測序。2.慢病毒包裝。陽性質(zhì)粒大量抽提擴(kuò)增,共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞,收集病毒上清,測定病毒滴度。3.構(gòu)建沉默Keap1的HaCaT細(xì)胞系。不同的慢病毒載體(空載體、Keap1 shRNA1/2/3)分別感染HaCa T細(xì)胞,感染復(fù)數(shù)(MOI)為5,48小時(shí)后,1μg/ml嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。4.穩(wěn)轉(zhuǎn)株的鑒定。培養(yǎng)上述經(jīng)過篩選獲得的穩(wěn)轉(zhuǎn)株,提RNA并定量,通過實(shí)時(shí)熒光定量(Real-Time Quantitative PCR)檢測細(xì)胞中Keap1 mRNA表達(dá)水平。5.采用MTT還原法檢測細(xì)胞生長狀況,確定LC50及染毒濃度,染毒濃度分別為LC50的1/100、1/50、1/10。6.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況。7.RT-PCR檢測細(xì)胞中Nrf2、Keap1、Bach1、MAPK/ERK、CBP、As3MT mRNA表達(dá)水平。8.ELISA試劑盒檢測細(xì)胞中GSH、HO-1、As3MT蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.慢病毒干擾載體構(gòu)建,經(jīng)基因測序,顯示與目的基因序列完全匹配。2.慢病毒滴度測試結(jié)果,為2×108TU/ml。3.建立的Keap1-KD穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中sh1最好,其基因的沉默效率為71%,作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。4.混合砷染毒模型細(xì)胞48h的LC50為290.00μmol/L,染毒濃度分別為LC50的1/100為2.90μmol/L,LC50的1/50為5.80μmol/L,LC50的1/10為29.00μmol/L。5.2.90μmol/L混合砷染毒促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡;隨染毒濃度增加(5.80μmol/L-29.00μmol/L)染毒時(shí)間(48h、72h)延長增殖水平下降,凋亡率迅速上升。6.低劑量(2.90、5.80μmol/L)短時(shí)間(8h、24h)混合砷染毒促進(jìn)模型細(xì)胞中Nrf2、Bach1、MAPK/ERK、CBP、As3MT mRNA的表達(dá),與對(duì)照組相比表達(dá)上調(diào):高劑量(29μmol/L)長時(shí)間(72h)混合砷染毒抑制模型細(xì)胞中各基因的表達(dá),與對(duì)照組相比表達(dá)下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7.低劑量(2.90、5.80μmol/L)短時(shí)間(24h、48h)混合砷染毒模型細(xì)胞能促進(jìn)As3MT、GSH、HO-1蛋白的表達(dá),隨染毒濃度(29μmol/L)增加時(shí)間延長(72h),As3MT、GSH、HO-1蛋白的表達(dá)量有所下降,但仍遠(yuǎn)高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.混合砷染毒能改變細(xì)胞中增殖與凋亡的比率,低劑量促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,高劑量抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。2.混合砷染毒模型細(xì)胞,Nrf2高表達(dá),隨著染毒時(shí)間延長、染毒濃度增加基因有下調(diào)趨勢,但明顯高于未轉(zhuǎn)染組。3.混合砷染毒能使模型細(xì)胞中Bach1、MAPK/ERK、CBP、As3MT mRNA表達(dá)和As3MT、GSH、HO-1蛋白表達(dá)發(fā)生改變,隨著染毒時(shí)間延長、染毒濃度增加基因表達(dá)由上調(diào)趨勢轉(zhuǎn)為下調(diào)趨勢。4.混合砷對(duì)模型細(xì)胞的毒性作用受時(shí)間和濃度交互作用的影響,可推測砷暴露隨著染毒時(shí)間的延長,染毒濃度的加大對(duì)皮膚細(xì)胞的損害越嚴(yán)重。
【關(guān)鍵詞】：亞砷酸鈉 HaCaT細(xì)胞 細(xì)胞凋亡 基因表達(dá) 慢病毒
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R114
【目錄】：

• 中英文縮略詞對(duì)照表5-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 前言12-14
• 材料與方法14-28
• 1.材料14-17
• 2.方法17-26
• 3.統(tǒng)計(jì)分析26
• 4.質(zhì)量控制26-27
• 5 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線27-28
• 結(jié)果28-50
• 討論50-58
• 小結(jié)58-59
• 致謝59-60
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 綜述66-79
• 參考文獻(xiàn)74-79
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)位論文79-80
• 附件 1:基因測序結(jié)果80-81
• 導(dǎo)師評(píng)閱表81

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本文編號(hào)：276876