本文關鍵詞：沉默Keap1基因對Nrf2相關基因表達的影響及在砷皮膚氧化應激損傷中作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:研究Keap1基因沉默對Nrf2相關基因表達在砷致皮膚細胞毒性中的作用,為砷致皮膚損傷提供理論依據(jù)。方法:1.慢病毒載體的構建。依據(jù)Keap1基因序列構建Keap1sh RNA,采用BamH I,EcoR I雙酶切載體,T4ligase連接載體與目的基因,經感受肽細胞轉化后,平板挑菌培養(yǎng),菌液測序。2.慢病毒包裝。陽性質粒大量抽提擴增,共轉293T細胞,收集病毒上清,測定病毒滴度。3.構建沉默Keap1的HaCaT細胞系。不同的慢病毒載體(空載體、Keap1 shRNA1/2/3)分別感染HaCa T細胞,感染復數(shù)(MOI)為5,48小時后,1μg/ml嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉株。4.穩(wěn)轉株的鑒定。培養(yǎng)上述經過篩選獲得的穩(wěn)轉株,提RNA并定量,通過實時熒光定量(Real-Time Quantitative PCR)檢測細胞中Keap1 mRNA表達水平。5.采用MTT還原法檢測細胞生長狀況,確定LC50及染毒濃度,染毒濃度分別為LC50的1/100、1/50、1/10。6.流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。7.RT-PCR檢測細胞中Nrf2、Keap1、Bach1、MAPK/ERK、CBP、As3MT mRNA表達水平。8.ELISA試劑盒檢測細胞中GSH、HO-1、As3MT蛋白表達水平。結果:1.慢病毒干擾載體構建,經基因測序,顯示與目的基因序列完全匹配。2.慢病毒滴度測試結果,為2×108TU/ml。3.建立的Keap1-KD穩(wěn)轉細胞株中sh1最好,其基因的沉默效率為71%,作為后續(xù)實驗細胞。4.混合砷染毒模型細胞48h的LC50為290.00μmol/L,染毒濃度分別為LC50的1/100為2.90μmol/L,LC50的1/50為5.80μmol/L,LC50的1/10為29.00μmol/L。5.2.90μmol/L混合砷染毒促進細胞增殖,抑制細胞凋亡;隨染毒濃度增加(5.80μmol/L-29.00μmol/L)染毒時間(48h、72h)延長增殖水平下降,凋亡率迅速上升。6.低劑量(2.90、5.80μmol/L)短時間(8h、24h)混合砷染毒促進模型細胞中Nrf2、Bach1、MAPK/ERK、CBP、As3MT mRNA的表達,與對照組相比表達上調:高劑量(29μmol/L)長時間(72h)混合砷染毒抑制模型細胞中各基因的表達,與對照組相比表達下調,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。7.低劑量(2.90、5.80μmol/L)短時間(24h、48h)混合砷染毒模型細胞能促進As3MT、GSH、HO-1蛋白的表達,隨染毒濃度(29μmol/L)增加時間延長(72h),As3MT、GSH、HO-1蛋白的表達量有所下降,但仍遠高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1.混合砷染毒能改變細胞中增殖與凋亡的比率,低劑量促進細胞增殖,抑制細胞凋亡,高劑量抑制細胞增殖,促進細胞凋亡。2.混合砷染毒模型細胞,Nrf2高表達,隨著染毒時間延長、染毒濃度增加基因有下調趨勢,但明顯高于未轉染組。3.混合砷染毒能使模型細胞中Bach1、MAPK/ERK、CBP、As3MT mRNA表達和As3MT、GSH、HO-1蛋白表達發(fā)生改變,隨著染毒時間延長、染毒濃度增加基因表達由上調趨勢轉為下調趨勢。4.混合砷對模型細胞的毒性作用受時間和濃度交互作用的影響,可推測砷暴露隨著染毒時間的延長,染毒濃度的加大對皮膚細胞的損害越嚴重。
【關鍵詞】：亞砷酸鈉 HaCaT細胞 細胞凋亡 基因表達 慢病毒
【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R114
【目錄】：

• 中英文縮略詞對照表5-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 前言12-14
• 材料與方法14-28
• 1.材料14-17
• 2.方法17-26
• 3.統(tǒng)計分析26
• 4.質量控制26-27
• 5 實驗技術路線27-28
• 結果28-50
• 討論50-58
• 小結58-59
• 致謝59-60
• 參考文獻60-66
• 綜述66-79
• 參考文獻74-79
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學位論文79-80
• 附件 1:基因測序結果80-81
• 導師評閱表81

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本文編號：276876